于廣晴，趙田華，倪 蕾，張小霞，趙悅榮

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，發(fā)病時(shí)骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖并抑制正常造血。該病發(fā)展快、預(yù)后差，病死率高。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。其治療方法仍主要以化療、骨髓移植為主，其副作用大，同時(shí)患者生存質(zhì)量差，故我們積極探討其發(fā)病原因的同時(shí)，迫切需要尋找一種能夠靶向治療急性白血病的方法，盡可能減少傳統(tǒng)化療方法的嚴(yán)重不良反應(yīng)。目前有關(guān)實(shí)體腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)的報(bào)道層出不窮，但是白血病治療靶點(diǎn)相關(guān)報(bào)道甚少。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其機(jī)制為在AL中Survivin蛋白可能是PLK1的靶基因之一，兩者可能發(fā)揮協(xié)同作用，相互促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。

腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在多種致瘤因素作用下產(chǎn)生的增生、分化異常的新生物。其主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)失控、凋亡受阻。近年有關(guān)報(bào)道指出，在這一系列復(fù)雜的過(guò)程當(dāng)中需要多種細(xì)胞組份參與，PLK1和Survivn就是這眾多組份中起關(guān)鍵作用的蛋白，它們的生物學(xué)功能與實(shí)體腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展關(guān)系密切[2，3]。本實(shí)驗(yàn)在于研究急性白血病患者骨髓細(xì)胞中PLK1和Survivn蛋白的表達(dá)水平及二者相關(guān)性，探討它們?cè)谂R床治療急性白血病中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 病例來(lái)源

隨機(jī)動(dòng)態(tài)選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011-10～2013-12期間54例初治AL患者骨髓細(xì)胞樣本，其中男32例，女22例；年齡10～75歲，中位年齡35歲。留取初治組完全緩解后標(biāo)本,其中ALL-CR組19例,AML-CR組11例。選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011-10～2013-12體檢其他方面均正常，既往身體健康，無(wú)其他系統(tǒng)疾病人群19例作為對(duì)照組，其中男9例，女10例，年齡22～69歲，中位年齡45.5歲。

1.2 標(biāo)本處理

取骨髓1mL，抗凝處理，加淋巴細(xì)胞分離液適量，離心，吸取單個(gè)核細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)量涂片制備好標(biāo)本玻片，用保鮮膜包裹密封后裝盒,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法及主要試劑

采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)PLK1和Survivin表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)所用試劑為SP-9002免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型鼠抗人PLK1單克隆抗體(0.2mL)購(gòu)于上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司。濃縮型鼠抗人Survivin單克隆抗體(0.lmL)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 判定結(jié)果

PLK1和Survivin陽(yáng)性細(xì)胞以細(xì)胞膜和(或) 細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淺黃或棕褐色顆粒計(jì)為染色陽(yáng)性。顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞(參考中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶結(jié)果判斷方法),按照染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)分，其中A(染色強(qiáng)度)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)即：0分為無(wú)色、1分為淺黃色、2分為綜黃色、3分為棕褐色；B(染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù))評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)即：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；A×B結(jié)果：0～1分、≥2分、2～3分、≥4分別為陰性(-)、弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性(+)、強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用卡方檢驗(yàn)對(duì)表達(dá)積分陽(yáng)性率進(jìn)行顯著性分析,相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman進(jìn)行,以α=0.05為檢驗(yàn)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組PLK1和Survivin表達(dá)水平

PLK1和Survivin在AML和ALL初治組患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著高于正常完全緩解組和正常對(duì)照組，差異具有顯著意義(P<0.05)；PLK1高表達(dá)組CR率低于低表達(dá)組,Survivin高表達(dá)組CR率低于低表達(dá)組,差異有顯著性(P<0.05)。說(shuō)明PLK1和Survivin得過(guò)表達(dá)對(duì)急性白血病的發(fā)生和惡性進(jìn)程可能產(chǎn)生了不同程度地影響，可作為急性白血病臨床預(yù)后判斷的檢測(cè)指標(biāo)。見(jiàn)表1～2。

2.2 PLK1和Survivin表達(dá)水平相關(guān)性

初治急性白血病(AL)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中PLK1的表達(dá)陽(yáng)性率為66.7%，Survivin的表達(dá)陽(yáng)性率為55.6%，PLK1的表達(dá)與Survivin的表達(dá)在AL中呈正相關(guān)(r=0.515,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 PLK1在初治AL各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)

*與正常對(duì)照比較，P<0.05;*與完全緩解組比較，P<0.05。

表2 Survivin在初治AL各組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)

*與正常對(duì)照比較，P<0.05;*與完全緩解組比較，P<0.05。

表3 初治AL中Survivin與PLK1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

3.1 PLK1在急性白血病骨髓細(xì)胞中的表達(dá)及意義

PLK1(polo-like kinase-1)它屬于Polo樣激酶家族PLKs(polo-like kinase)的一員，由瑞士實(shí)驗(yàn)室腫瘤研究所的Golsteyn等在1994年最先報(bào)道[4]。生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究提示，Plk1 是細(xì)胞周期相關(guān)事件的重要調(diào)節(jié)因子，參與到細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期檢驗(yàn)等過(guò)程，所有這些生物學(xué)功能均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PLK1在初治組AL患者骨髓單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)增高，其細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞漿的陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%，PLK1在髓系和淋巴系的表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯增高(陽(yáng)性率分別為：63.6%、71.4%、5.3%),差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,PLK1在初治AL中的表達(dá)與完全緩解后(CR)后的表達(dá)(陽(yáng)性率分別為66.7%、13.3%)相比,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而且初治AML與AML-CR(陽(yáng)性率分別為63.6%、5.3%)相比，初治ALL與ALL-CR(陽(yáng)性率分別為71.4%、27.3%)相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PLK1高表達(dá)組的完全緩解(CR)率低于PLK1低表達(dá)組的完全緩解(CR)率，分別為35.6%、67.6%,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外有關(guān)報(bào)道顯示出了相同結(jié)果[3]。故PLK1有可能作為急性白血病診斷、治療和預(yù)后的指標(biāo)應(yīng)用于臨床，并成為急性白血病的治療新的靶點(diǎn)。

3.2 Survivin在急性白血病骨髓細(xì)胞中的表達(dá)及意義

Survivin(生存素)是于1997年由耶魯大學(xué)的Ambrosini G等應(yīng)用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1cDNA在人類(lèi)基因組庫(kù)的雜交篩選中首先分離出來(lái)。其分子量為16.5KD。Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白( IAP)家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的一個(gè)新成員，并且是分子量最小的IAP成員[5]。Survivin參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要機(jī)制是與AuroraB和INCENP結(jié)合形成一個(gè)染色體通道蛋白復(fù)合體定位于著絲粒和中間體上進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期,它主要參與了紡錘體的組裝以及細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)控，同時(shí)肩負(fù)著對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)控，最近更有報(bào)道指出 Survivin與新生血管形成關(guān)系密切。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Survivin在初治急性白血病患者骨髓細(xì)胞中過(guò)度表達(dá),其細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞漿陽(yáng)性率達(dá)到55.6%，Survivin在髓細(xì)胞白血病和淋巴細(xì)胞白血病(陽(yáng)性率分別為54.5%、57.1%)的表達(dá)較對(duì)照組(陽(yáng)性率為10.5%)均有明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但Survivin在髓細(xì)胞白血病和淋巴細(xì)胞白血病的表達(dá)相比,其差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示Survivin在初治急性白血病中的表達(dá)與完全緩解(CR)后的表達(dá)(陽(yáng)性率分別為55.6%、10%),其差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；并且初治AML與AML-CR(陽(yáng)性率分別為54.5%、5.3%)、初治ALL與ALL-CR(陽(yáng)性率分別為57.1%、18.2%)之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故我們有理由相信未來(lái)Survivin可作為臨床診斷和治療的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,Survivin高表達(dá)組與低表達(dá)組相比其完全緩解(CR)率明顯降低，分別為31.6%、68.6%,其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kitada等發(fā)現(xiàn),抗凋亡蛋白Survivin的高表達(dá)與低完全緩解(CR)率相關(guān)(P=0.05)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。這不禁使我們相信Survivin有希望作為臨床預(yù)后判斷指標(biāo)被廣泛推廣。近幾年Survivin在實(shí)體瘤中研究報(bào)道指出,Survivin的過(guò)度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特性關(guān)系密切。

3.3 急性白血病骨髓細(xì)胞中PLK1和Survivin的關(guān)系及意義

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控的過(guò)程，細(xì)胞周期的各個(gè)要素均參與這一過(guò)程中，綜上所述，PLK1和Survivin蛋白參與細(xì)胞有絲分裂調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)控、細(xì)胞周期檢驗(yàn)等各各方面。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PLK1和Survivin的表達(dá)呈正相關(guān)，提示它們?cè)贏L的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起協(xié)同作用，共同促進(jìn)急性白血病的發(fā)生發(fā)展。

近年的研究表明，PLK1和Survivin亦可參與腫瘤新生血管的形成，并且在其發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起到主要作用。故針對(duì)二者的生物學(xué)作用為靶點(diǎn)的新的治療白血病的方法，有望為急性白血病治療開(kāi)辟新的思路，提供廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究和探索。

[1]Toyoshima Morimoto F, Taniguchi E, Nishida E，et al.PLK1promotes nuclear translocation of human Cdc25C during prophase[J].Clin Cancer Res,2002,3(4):8-7

[2]Sunkel,CE，DM Glover，Polo, et al.A mitotic mutant of Drosophila displaying abnormal spindle poles[J].Cell Sci,1988,89 (10):25-38

[3]Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, et al.Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an “off-target” effect [J].Mini Rev Med Chem, 2007,96(12): 1035-1039

[4]Mori A,Wana H,Nishimura Y, et al.Expression of the apoptosis gene survivin in human leukemia[J].Int J Hematol, 2002, 75(2):161-165

[5]張純，張淑萍，樊英麗，等.抗凋亡蛋白survivin在急性白血病細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2003，26(6)：3-4