穆國軍，李曉迪，顧鏡月，李惠玲，張偉東，郭海濤

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)，是指由乏氧引起大腦水腫、軟化和壞死等一種病變，是新生兒期致殘的主要病因[1～3]。而如何改善大腦微循環(huán)障礙及腦部水腫狀態(tài)，保護(hù)大腦神經(jīng)組織，控制驚厥，是防治本病的重要環(huán)節(jié)[4～6]。本實(shí)驗(yàn)首先通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑—ORS及改善腦微循環(huán)障礙藥物—NBP，并通過檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組動物大腦組織含水量、超氧化物歧化酶(SOD)含量及水通道蛋白-4(AQP-4)和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)表達(dá)情況證實(shí)藥物的可靠疊加性效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級Wistar新生大鼠100只，雌雄不限，出生后7d(相當(dāng)于人類新生兒期)。佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑

SOD試劑盒(上海生工生物科技公司)，ORS，NBP，AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠多克隆抗體及二抗(Sigma 美國)。

1.3 制備動物模型

經(jīng)乙醚麻醉后，取頸部正中切口，分離結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，放入含有8%氮?dú)夂?%氧氣的密閉容器持續(xù)2h，制備成HIE模型。將出現(xiàn)左旋或夾尾左旋者納入試驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

出生7d大鼠共分為4組，每組25只。正常組:分離左側(cè)頸總動脈后在動脈下置線, 不結(jié)扎亦不低氧。模型組:制備大鼠HIE模型立即腹腔注射生理鹽水0.1mL/只。對照組: 模型后立即腹腔注射ORS 100mg/kg，即12h，1d，3d，7d在HIE后即刻給藥一次；實(shí)驗(yàn)組: 模型完成后立即腹腔注射ORS 100mg/kg，30min后腹腔注射丁基苯酞 10mg/kg，給藥次數(shù)同對照組。

1.5 樣品處理

按照不同時(shí)間點(diǎn)處死各組動物，大鼠經(jīng)拉頸處死后迅速于冰上開顱分離腦組織，按不同檢測目的分別儲存大腦及部分腦干脊髓組織。

2 方法

2.1 腦組織含水量的測定

采用干濕質(zhì)量法測定腦組織含水量。取各組等量腦組織濾紙吸干表面水分后電子天平稱量濕重，再將組織置于80℃烘箱烤干測恒重，按Ellis公式，腦含水量=〔(濕重-干重)/濕重〕×100%計(jì)算含水量。

2.2 SOD活性測定

按SOD測定試劑盒說明檢測大腦組織總超氧化物歧化酶活力(測吸光度值，從而計(jì)算勻漿組織的總SOD活力)。

2.3 免疫組化

取左腦組織，常規(guī)組織樣品包埋及組織切片制備進(jìn)行免疫組化檢測。首先對組織載玻片進(jìn)行脫蠟與復(fù)水處理。再將其入3%H2O2液中浸泡15min，經(jīng)蒸餾水沖洗3min×1次，0.01M PBS液沖洗2min×3次，經(jīng)抗原修復(fù)后，加入AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠多克隆抗體，每張切片50μL。4℃冰箱過夜。0.01M PBS液沖洗2min×3次后滴加生物素化二抗每張切片50μL，濕盒37℃過夜后0.01M PBS液沖洗2min×3次，滴加S-A/HRP室溫孵育15min。0.01M PBS液沖洗2min×3次后DAB顯色。經(jīng)復(fù)染、脫水透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察陽性細(xì)胞表達(dá)。

2.4 western blot檢測

對各組樣品進(jìn)行組織總蛋白提取并定量。分別取等量總蛋白(25μg/孔)加上樣緩沖液于沸水中煮5 min，以10%SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后將凝膠上的蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%小牛血清白蛋白BSA的TBST溶液封閉2h，分別加入AQP-4及CREB蛋白兔抗鼠抗體，4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL化學(xué)發(fā)光，X線顯影，掃描。以GAPDH蛋白水平作為內(nèi)參對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析， 所得所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腦組織含水量

本實(shí)驗(yàn)采用濕重法檢測腦組織含水量進(jìn)以表示腦水腫程度。結(jié)果顯示模型組12h即可出現(xiàn)腦水腫，而后呈上升趨勢，3d后達(dá)到高峰，之后有下降，各時(shí)間點(diǎn)與空白組比較有差異性(P<0.05)。較模型組，實(shí)驗(yàn)組及對照組含水量明顯下降，且實(shí)驗(yàn)組下降量高于對照組，同一時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異性有顯著意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組動物各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量測定

與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)。

3.2 腦組織SOD含量測定

顯示模型組12h即可出現(xiàn)SOD下降趨勢，而后持續(xù)下降，3d后達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)與空白組比較有差異性(P<0.05)。較模型組，實(shí)驗(yàn)組及對照組SOD含量明顯上升，且實(shí)驗(yàn)組高于對照組，同一時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異性有顯著意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組動物各時(shí)間點(diǎn)腦組織SOD含量測定

與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)。

3.3 免疫組化染色

3d時(shí)，空白組可見AQP-4呈弱陽性表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化(圖1A)。模型組各時(shí)間點(diǎn)與空白組比較染色較深，數(shù)量多(圖1B)，但各時(shí)間點(diǎn)免疫陽性細(xì)胞灰度值較空白組低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。與模型組比，實(shí)驗(yàn)組及對照組各時(shí)間點(diǎn)AQP-4灰度值均相對較低(圖1C-1D)，且實(shí)驗(yàn)組低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CREB蛋白在空白組3d時(shí)呈高表達(dá)，模型組較空白組比較染色淺，數(shù)量少。與模型組比，實(shí)驗(yàn)組及對照組各時(shí)間點(diǎn)CREB蛋白灰度值均相對較高(圖1C-1D)，且實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.4 western blot檢測

蛋白印跡顯示說明模型組較空白組AQP-4蛋白表達(dá)水平明顯上升，CREB蛋白蛋白表達(dá)明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組較模型組CREB蛋白表達(dá)水平明顯升高，AQP-4蛋白表達(dá)下降，差異有顯著意義(P<0.05)；對照組AQP-4較模型組有下降，但高于實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組AQP-4蛋白表達(dá)高于對照組但接近空白組，差異具有顯著性(P<0.05)，見圖2。

圖1 3d時(shí)實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色

圖2 各組AQP-4及CREB蛋白在3d時(shí)蛋白表達(dá)情況

4 討論

新生兒缺氧缺血性腦病以其高發(fā)病率及高致殘率成為威脅人類健康的重要病變。它的發(fā)病因素主要指由圍生期呼吸驟停及嚴(yán)重肺部感染所致的缺氧及嚴(yán)重系統(tǒng)疾病所致的缺血，發(fā)病機(jī)制涉及到血流動力學(xué)變化、腦細(xì)胞能量代謝衰竭、再灌注損傷及神經(jīng)損傷。HIE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是各種機(jī)制綜合一起的連鎖反應(yīng)，大量研究證實(shí)多數(shù)神經(jīng)元不是死于缺氧缺血時(shí)，而是死于缺血缺氧后數(shù)小時(shí)至數(shù)天，這種遲發(fā)型的細(xì)胞死亡是可以通過發(fā)病后的干預(yù)來預(yù)防及減輕病癥的。

目前關(guān)于HIE的藥物及方法主要集中在改善腦水腫和微循環(huán)障礙、消除自由基和保護(hù)大腦神經(jīng)組織等方面。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了HIE模型的制備，然后選用神經(jīng)保護(hù)劑藥物ORS及改善腦微循環(huán)障礙藥物—NBP，在試驗(yàn)中的聯(lián)合運(yùn)用中增加疊加效應(yīng)，對大鼠的早期HIE的治療起到了改善作用。通過對本實(shí)驗(yàn)中對大鼠分組用藥后不同時(shí)間點(diǎn)的檢測，可以發(fā)現(xiàn)與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組的大腦含水量低于對照組，說明所選藥物在改善腦水腫方面有比較好的改善作用。通過SOD活性含量的檢測，也可以發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的SOD活性明顯增加高于對照組，說明藥物的聯(lián)合運(yùn)用在改善腦神經(jīng)活性方面也有優(yōu)勢作用。目前國內(nèi)外研究證實(shí)，AQP-4與腦水腫的形成有關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，模型組在缺氧缺血下AQP-4上調(diào)了其表達(dá)，在第3天達(dá)到高峰，這與腦組織水腫的發(fā)生與發(fā)展時(shí)間上基本一致，說明了AQP-4在腦水腫中有重要作用。國外有研究表明，AQP-4的表達(dá)的抑制，可避免神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過度腫脹，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹是由于再氧后水外排速度減慢所致，所以AQP-4對于缺氧缺血性腦病有雙向的水介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白是腦缺血神經(jīng)元存活心肌缺血或谷氨酸預(yù)處理后的一個(gè)重要媒介，谷氨酸NMDA受體門控鈣離子內(nèi)流和后續(xù)的CaMⅡ—Ⅳ的活化誘導(dǎo)CREB的磷酸化，細(xì)胞應(yīng)激(例如缺血等)時(shí)磷酸化的CREB(phosphorylation of c-AMP response element binding protein，p-CREB)提供了神經(jīng)保護(hù)性作用，因而重新評價(jià)興奮性氨基酸拮抗劑的保護(hù)作用具有重要意義。本試驗(yàn)通過免疫組化及western blot檢測發(fā)現(xiàn)AQP-4在HIE后12h表達(dá)既有升高，1d明顯增強(qiáng)，3d后達(dá)高峰，與腦含水量變化一致，再次證實(shí)了AQP-4參與了HIE后腦水腫的形成，通過本實(shí)驗(yàn)藥物的運(yùn)用過程中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組與對照組同時(shí)間點(diǎn)下AQP-4呈低表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組低于對照組，說明了藥物在抑制早期HIE發(fā)病過程中具有明顯意義，而CREB在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)較模型組也比較明顯，接近空白組，并結(jié)合這兩種藥物的保護(hù)神經(jīng)組織作用及改善微循環(huán)的意義，說明了兩種藥物的疊加效應(yīng)是有意義的。

通過本實(shí)驗(yàn)的研究證明，藥物在HIE的治療過程中顯示了強(qiáng)大應(yīng)用前景，在本實(shí)驗(yàn)HIE的治療過程中，藥物的作用可以下調(diào)AQP-4表達(dá)，減輕腦水腫，也初步顯示了神經(jīng)保護(hù)作用，為下一步研究工作奠定了基礎(chǔ)，但是實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用存在一定差異，且由于時(shí)間關(guān)系本實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用劑量及周期未作進(jìn)一步研究，希望在以后的研究中可以得到進(jìn)一步深化。

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