楊清嶺，連 爽，趙 王月，李寶花，莫文靜

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童牙病科，黑龍江 佳木斯 154002)

齲病是人類最常見的口腔疾病，其中與齲病密切相關(guān)的變形鏈球菌是口腔中最常檢出的致齲菌，它能發(fā)酵出多種碳水化合物產(chǎn)生乳酸，其產(chǎn)酸力、速度、耐酸性均強(qiáng)于其他口腔鏈球菌，可在pH低至4.2的環(huán)境中生存。它的致齲因素主要在于對(duì)牙面的黏附、聚集、產(chǎn)酸以及耐酸，乳酸脫氫酶將細(xì)菌代謝的中間產(chǎn)物丙酮酸還原成乳酸，造成牙面的酸性環(huán)境，而這些是齲病發(fā)生的首要條件，因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究混合液對(duì)變形鏈球菌生長、產(chǎn)酸的作用，且進(jìn)一步探討混合液對(duì)變形鏈球菌代謝產(chǎn)酸的機(jī)制。近年來，天然提取物因來源豐富、取材方便、療效好、副作用輕微而引起人們的關(guān)注。鑒于蜂膠是一種天然的生物材料，具有廣泛的藥理作用，抑菌效果好、毒副作用小，但有一定的苦澀感；檸檬提取物有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，其主要成分具有較強(qiáng)的抗炎活性，能抑制細(xì)菌、真菌、病毒的生長繁殖，沒有毒副作用，而且口感芳香。本實(shí)驗(yàn)研究探討將這兩種天然物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用于防齲，為兩者混合液防齲的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蜂膠(水溶性，純度98%)，檸檬提取物(精細(xì)粉末，100%通過80目)(購于西安森卓生物科技有限公司)；變形鏈球菌(菌株編號(hào)為ATCC25175，由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院提供)；BHI瓊脂培養(yǎng)基，BHI液體培養(yǎng)基(購于杭州天和微生物試劑有限公司)；漱爽復(fù)方氯已定含漱液(哈爾濱樂泰藥液有限公司)；噻唑藍(lán)MTT(上海金穗生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。

1.2 變形鏈球菌菌懸液制備

將凍干保存的菌種S.m于液體BHI培養(yǎng)基中復(fù)蘇，37℃厭氧培養(yǎng)24h，經(jīng)革蘭染色鏡檢為純培養(yǎng)后，用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至0.5 McFarland(108CFU/mL) 。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥液的制備

將固體水溶性蜂膠溶解于無菌液體BHI中，攪拌使其充分溶解，濾去未溶解部分蜂膠，經(jīng)計(jì)算配置成100mg/mL蜂膠母液，用BHI液體培養(yǎng)基將蜂膠稀釋成以下濃度0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL；同理制備100mg/mL檸檬提取物母液，用BHI液體培養(yǎng)基將檸檬稀釋成以下濃度：12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL。

1.4 混合液對(duì)變形鏈球菌生長的影響

1.4.1 確定蜂膠、檸檬單組份的MIC值

用MTT法測(cè)蜂膠、檸檬各濃度組OD值，并計(jì)算抑菌率，當(dāng)抑菌率達(dá)到80%時(shí)的最小濃度即為其MIC值。本實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對(duì)照組(氯已定加菌液)、陰性對(duì)照組(液體培養(yǎng)基加菌液)、空白對(duì)照組(液體培養(yǎng)基)。抑菌率=(陰性對(duì)照OD值-實(shí)驗(yàn)OD值)/(陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照OD值)×100(%)。

1.4.2 確定混合液的MIC值

MTT法測(cè)蜂膠、檸檬各濃度組混合液的OD值，在96孔板上每一橫排分別加入0.78、0.5、0.39、0.2、0.1mg/mL蜂膠溶液100μL，縱排加入12.5、10、6.25、3.13、1.56mg/mL檸檬提取物溶液100μL，此時(shí)蜂膠濃度為0.39、0.25、0.2、0.1、0.05mg/mL，檸檬提取物溶液濃度為6.25、5、3.13、1.56、0.78mg/mL。兩溶液充分混勻后，每孔分別加入準(zhǔn)備好的菌液20μL，并設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。于37℃(90%N2,10%CO2)厭氧培養(yǎng)24h，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD值并計(jì)算，當(dāng)抑菌率達(dá)到80%時(shí)的最小濃度為其MIC值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)

根據(jù)單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的抑菌效果，計(jì)算分級(jí)抑制濃度(FIC)指數(shù)，從而檢測(cè)兩者的抗菌作用關(guān)系。FIC=蜂膠聯(lián)合時(shí)MIC/蜂膠單獨(dú)時(shí)MIC+檸檬聯(lián)合時(shí)MIC/檸檬單獨(dú)時(shí)MIC。當(dāng)FIC≤0.5時(shí)為協(xié)同作用，0.52時(shí)為拮抗作用。

1.5 蜂膠-LPE對(duì)S.m產(chǎn)酸能力的影響

利用二倍稀釋法配置如下四個(gè)濃度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(設(shè)空白對(duì)照組)，按菌液與藥物混合液1：10(v/v)比例接種S.m，37℃厭氧培養(yǎng)24h，離心(1500r/min,20min)取上清液，用pH計(jì)測(cè)定pH，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算pH的變化：△pH=初始pH(7.4)-終末pH。

1.6 蜂膠-LPE對(duì)S.m乳酸脫氫酶活性的影響

利用二倍稀釋法配置如下四個(gè)濃度：1/2、1/4、1/8、1/16MIC(設(shè)空白對(duì)照組)，按菌液與藥物混合液1：10(v/v)比例接種S.m，37℃厭氧培養(yǎng)24h，離心(3300r/min,20min)，取上清液備用。每管中的上清液利用二硝基苯肼法測(cè)乳酸脫氫酶活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 變形鏈球菌分別在不同濃度蜂膠溶液和LPE中的生長情況見表1、2。

蜂膠溶液和LPE抑菌率在80%以上的最小濃度分別為0.39mg/mL和6.25mg/mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定蜂膠MIC值為0.39mg/mL，LPE的MIC值為6.25mg/mL。

表1 不同濃度蜂膠溶液對(duì)S.m的抑制情況

注：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

表2 不同濃度LPE對(duì)S.m的抑制情況

注：各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 變形鏈球菌在不同濃度蜂膠溶液和 LPE混合液中的抑制情況

由表3可以計(jì)算出抑菌率：蜂膠0.2mg/mL，LPE5mg/mL時(shí)為82.72%，蜂膠0.25mg/mL，LPE1.56mg/mL時(shí)為84.28%，均可以達(dá)到抑制S.m的MIC值。蜂膠與LPE聯(lián)用時(shí)，其MIC值為0.2mg/mL，LPE與蜂膠聯(lián)用時(shí)，其MIC值為1.56mg/mL，根據(jù)公式計(jì)算得FIC=0.75。表明蜂膠與LPE聯(lián)用時(shí)為相加作用。

表3 蜂膠-LPE混合液抑制S.m OD值

2.3 混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸能力及乳酸脫氫酶活性的影響

選用蜂膠0.2mg/mL，LPE5mg/mL作為兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的MIC值，以二倍稀釋法配制低于此MIC的4個(gè)濃度梯度混合液，其對(duì)S.m產(chǎn)酸能力及抑制LDH活性，見表4。結(jié)果顯示：S.m的產(chǎn)酸能力及抑制LDH活性隨混合液濃度的增加而明顯降低。各濃度組與陰性對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表4 蜂膠-LPE混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸的影響

注：各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

研究表明變形鏈球菌是主要的致齲菌。耐酸性是變形鏈球菌致齲的重要毒力之一，進(jìn)食碳水化合物后，口內(nèi)菌斑變化范圍很廣，Stephen曲線表明，菌斑pH可以在20min內(nèi)從7.0迅速下降至3.0～4.0。在胞外pH為4.0時(shí)，變形鏈球菌仍有質(zhì)子流動(dòng)和合成ATP，糖酵解繼續(xù)進(jìn)行，這保證了變形鏈球菌的高耐酸性，且在低pH下耐酸性反而增強(qiáng)，這使得變形鏈球菌在低pH環(huán)境下更具致齲性和生存優(yōu)勢(shì)。利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)生乳酸是致齲菌的重要特征，抑制變形鏈球菌乳酸脫氫酶活性，減少細(xì)菌產(chǎn)乳酸量，改變牙菌斑的酸性環(huán)境，是控制齲病發(fā)生的途徑之一。許多學(xué)者已進(jìn)行過不少防治齲病的藥物研究，發(fā)現(xiàn)抗生素類、氯已定及其相關(guān)化合物對(duì)齲病有較好的防治作用，但是抗生素毒副作用過大及細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的問題因而最終難以在齲病預(yù)防中推廣。變鏈菌有抑制作用。然而，使用單味藥抗菌，其單純的抑菌或殺菌作用，可能對(duì)口腔因而本實(shí)驗(yàn)研究將蜂膠與檸檬提取物聯(lián)合應(yīng)用于防齲，探討這兩種物質(zhì)的混合液的抗菌機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蜂膠抗菌有效成分為黃酮類化合物、松屬素、高良姜素等，蜂膠的抗菌作用原理十分復(fù)雜，Popova等研究發(fā)現(xiàn): 黃酮類成分能夠分解細(xì)菌胞膜的能量，限制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)；Marcucci MC等發(fā)現(xiàn):蜂膠對(duì)不同細(xì)菌和霉菌不但具有直接抑制作用，而且能夠抑制細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附。檸檬提取物是從水果皮中提取出來的,有50多種有效成分,橘皮含有橙皮素、橙皮苷、橘櫞酸及還原糖、揮發(fā)油、α-蒎烯、β-水芹烯。研究報(bào)告指出,檸檬提取物的主要成分為橘皮苷和橙皮素都能被腸胃吸，且表明檸檬提取物具有良好的生物安全性，能有效抑制口腔主要致齲菌的生長，是具有潛力的防齲藥物。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量兩種藥物單獨(dú)作用時(shí)的MIC值，和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的MIC值，經(jīng)過計(jì)算和對(duì)比，兩提取物聯(lián)合應(yīng)用防齲，達(dá)到了降低單組分的使用劑量和毒副作用。

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