高紅艷，陳繼明，何援利

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510280；2.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇常州 213003)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是子宮內(nèi)膜損傷后發(fā)生的纖維化病變[1]，其治療是臨床工作的一大難題。子宮內(nèi)膜由2層組成,即單層柱狀上皮與固有層。柱狀上皮主要由具有分泌功能的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cell,EEC)構(gòu)成；固有層的結(jié)締組織細(xì)胞主要為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cel1,ESC)，屬于成纖維細(xì)胞[2-6]。為研究ESC的生理功能,細(xì)胞間相互作用的應(yīng)答機(jī)制,建立ESC體外培養(yǎng)體系進(jìn)行分析是最理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究采用二次酶消化、一次網(wǎng)篩和差時貼壁純化等方法成功分離和純化了人ESC，建立了一種簡單高效的ESC原代培養(yǎng)方法,為進(jìn)一步深入研究IUA的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并提供了可靠的體外細(xì)胞試驗(yàn)研究平臺?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年12月至2014年3月蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者10 例，年齡40～45 歲。10例患者術(shù)前3 個月均未用過激素治療，無內(nèi)分泌疾病及全身性疾病，在開腹行全子宮切除術(shù)后，2例于無菌條件下刮取部分子宮內(nèi)膜，8例切取部分子宮內(nèi)膜，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)確診均為增生期子宮內(nèi)膜，于2 h內(nèi)用冰盒運(yùn)往試驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)儀器及試劑 (1)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(3111 型)，購自Thermo公司；倒置熒光顯微鏡(EcellSens19)，購自O(shè)lympus公司；凈化工作臺(SW-CF-2FD)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；臺式低速離心機(jī)(80-2 型)，購自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，購自Fisher Scientific 公司；細(xì)胞培養(yǎng)孔板，購自Fisher Scientific 公司；冰箱(BCD-216 型)，購自青島海爾股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9082 型)，購自上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；微量移液器，購自Thermo公司。(2)試劑：DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司；FBS購自Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司；SP 免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Triton X-100購自Sigma Aldrich公司；3%H2O2購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液(批號：041M0014V)購自Sigma公司；PBS檸檬酸緩沖液 (pH=7.4)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；波形蛋白抗體：santa，sc-32322；角蛋白抗體：sc-8018；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體：abcam，ab136817。

1.2.2ESC分離 收集臨床手術(shù)子宮內(nèi)膜及刮取的子宮內(nèi)膜立即放入盛有Dmem-F12培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基1∶1 混合，含10% 胎牛血清，100 U/mL 青霉素，0.2 mg/mL 鏈霉素，以下簡稱D-F培養(yǎng)基) 的無菌平皿中，2 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)。于超凈臺中無菌操作，用PBS液洗滌3次,剔除血塊及黏液，剪碎至糊狀，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入0.125 mg/mL胰酶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化5～10 min。1 000 r/min，離心3 min，棄上清液。向組織沉淀中加入0.8 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶(體積比1∶5)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化約60 min，每15 min 震蕩離心管1次。反復(fù)吹打消化懸液，靜止，待剩余糊狀組織沉淀后，小心吸取細(xì)胞懸液，經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾。濾液1 000 r/min，離心8 min，沉淀獲得較高純度的基質(zhì)細(xì)胞及少量腺上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞。60 min大部分基質(zhì)細(xì)胞貼壁后換液,PBS漂洗2次后置入新鮮培養(yǎng)液，即獲得較高純度的腺上皮細(xì)胞。24 h后換液除去未貼壁的死細(xì)胞和血細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 將分離所得的ESC分別用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，在 100 mL培養(yǎng)瓶中按(2～5)×105個/cm2的密度進(jìn)行接種,放置在5% CO237 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每48 h 觀察并換液1次。

1.2.4傳代培養(yǎng) 在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，可見細(xì)胞在約5～6 d后長滿培養(yǎng)瓶底,即可傳代。吸去培養(yǎng)上清液后,加入2.5 mg/mL的胰蛋白酶進(jìn)行消化，在顯微境下觀察到細(xì)胞收縮變圓后,再吸去消化液,重新加入培養(yǎng)液,然后用吸管吹打使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁吹打下來,按(2～5)×105個/cm2擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.5ESC表型純度免疫組織化學(xué)鑒定 細(xì)胞爬片培養(yǎng)后，用4%甲醛固定15 min，加入鼠抗人波形蛋白單抗和細(xì)胞角蛋白單抗(PBS代替一抗作空白對照)，4 ℃過夜，加入經(jīng)生物素標(biāo)記的二抗，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,以DAB顯色后，采用蘇木精進(jìn)行復(fù)染,放置光鏡下觀察。陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃染色，而陰性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)未被染色。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 10份子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中，7份培養(yǎng)成功,培養(yǎng)未成功的3份標(biāo)本均為分離得到的基質(zhì)細(xì)胞過少所致，其中2例為刮宮手術(shù)獲得，另1例從切取的子宮標(biāo)本中獲得。本研究中，細(xì)胞培養(yǎng)液及運(yùn)送液中均加入100 U/mL青霉素及0.2 mg/mL鏈霉素，未發(fā)生真菌或其他細(xì)菌感染，但凍存細(xì)胞復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)70%有細(xì)菌污染。

2.2形態(tài)學(xué)觀察 分離所得的間質(zhì)細(xì)胞為單個細(xì)胞，細(xì)胞在接種30 min后開始出現(xiàn)貼壁，2 h貼壁基本完成。間質(zhì)細(xì)胞初貼壁時為多邊形,在4～6 d后爬滿瓶壁的細(xì)胞變?yōu)殚L梭形或是紡錘形，胞體較小，具有成纖維細(xì)胞形態(tài)。本研究獲得了純度超過95%的ESC，間質(zhì)細(xì)胞中偶見上皮細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)(<5%)，培養(yǎng)至P5代基本停止增殖。間質(zhì)細(xì)胞傳代的次數(shù)越多,其純度就越高。

2.3免疫組織化學(xué)方法鑒定結(jié)果 波形蛋白在ESC中呈陽性表達(dá)，其細(xì)胞質(zhì)顯棕黃色顆粒(圖1)，而EEC表達(dá)角蛋白，PBS空白對照細(xì)胞質(zhì)均未著色。隨機(jī)取5個×200倍視野，計算波形蛋白著色細(xì)胞即基質(zhì)細(xì)胞比例。在原代培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，波形蛋白在95%以上的基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域?yàn)閺?qiáng)陽性表達(dá)，同時角蛋白為陰性表達(dá)。見圖1。

A：波形蛋白陰性對照(×200)；B：角蛋白陰性對照(×200)；C：波形蛋白陽性表達(dá)(×200)；角蛋白陰性表達(dá)(×200)。

圖1免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果

3 討 論

IUA是子宮內(nèi)膜損傷后發(fā)生的纖維化病變。子宮內(nèi)膜主要由基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞組成，基質(zhì)細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞。因此，為研究ESC的生理功能及細(xì)胞間的相互作用的應(yīng)答機(jī)制,建立ESC體外培養(yǎng)體系進(jìn)行分析是最理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

有研究發(fā)現(xiàn)，分離的細(xì)胞活力、純度及接種密度直接關(guān)系到ESC原代培養(yǎng)的成功與否[7]。在增生期,子宮內(nèi)膜以基質(zhì)細(xì)胞為主[8]，根據(jù)這一特點(diǎn)，本研究在分離細(xì)胞時，收集增生期子宮內(nèi)膜，從而提高了原代細(xì)胞的產(chǎn)量。正常的子宮內(nèi)膜由單層柱狀上皮和固有層組成。本研究分離基質(zhì)細(xì)胞的子宮內(nèi)膜有2個來源,分別是從手術(shù)切除后的子宮刮取和切取獲得。10份子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中，7份培養(yǎng)成功,培養(yǎng)成功率與Ryan等[3]的研究結(jié)果相似。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2例刮取的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)消化后取得的細(xì)胞主要為腺上皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞較少而失敗，另1例從子宮標(biāo)本切取的內(nèi)膜組織也因基質(zhì)細(xì)胞較少而失敗?？偨Y(jié)以上的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，后試驗(yàn)改為切取組織至少厚度達(dá)5 mm，面積大于1.5 cm2，余下的所有7例均獲成功。這與相關(guān)研究通過刮宮取材即可成功高效分離ESC的經(jīng)驗(yàn)不同[9-10]。

據(jù)文獻(xiàn)報道,ESC易受到陰道細(xì)菌的污染而可能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[4]。在本研究中，培養(yǎng)液及運(yùn)送液中都加了100 U/mL青霉素及0.2 mg/mL鏈霉素，沒有發(fā)生真菌或其他細(xì)菌感染。但凍存細(xì)胞復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)70%有細(xì)菌污染，有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步改進(jìn)。對于纖維較多的內(nèi)膜組織來說,酶法是最常用的方法。大多數(shù)研究者選用膠原酶，酶濃度為0.1%～1.0%，消化時間為40～120 min[8,11-13]。本研究先用0.125 mg/mL胰酶消化5～10 min，再用0.8 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶(體積比1∶5)消化約60 min，在較短的時間內(nèi)消化獲得了較多的組織細(xì)胞，降低了對細(xì)胞的破壞。Osteen等[5]學(xué)者使用二次過濾法分離EEC和ESC，獲得的ESC純度較高，但EEC生長不良。蔣洲梅等[6]通過低速離心與高密度接種的方法分離此2種細(xì)胞,提高了EEC的純度，但降低了ESC的純度。本試驗(yàn)?zāi)康膬H分離基質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)基質(zhì)細(xì)胞體積小，腺上皮細(xì)胞體積大且易成團(tuán)的特點(diǎn)，僅行一次400目網(wǎng)篩法，有效降低了細(xì)胞的丟失。分離所得的體積小的間質(zhì)細(xì)胞多在2 h內(nèi)完成貼壁；而體積較大的腺上皮細(xì)胞則相互聚集，無法通過400目的篩網(wǎng),在2 h后才開始貼壁。本研究有效利用這種差異,采用一次性的400目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾及分時段的貼壁方法成功純化細(xì)胞,同時對混雜在子宮內(nèi)膜中的大量紅細(xì)胞，采用逐次換液的方法進(jìn)行清除,取得了良好的效果,且將其他干預(yù)因素對培養(yǎng)細(xì)胞的影響有效排除,獲得了純度超過95%的ESC，此與譚先杰等[4]的試驗(yàn)結(jié)果相類似。此外,細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)不隨原代細(xì)胞的分離過程而改變,因而在鑒定培養(yǎng)結(jié)果時，可采用針對在體細(xì)胞抗原的特異抗體對離體細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記[14-16]。本試驗(yàn)細(xì)胞鑒定中波形蛋白成功免疫染色,證明采用本試驗(yàn)方法培養(yǎng)所得的原代細(xì)胞并未改變其固有的細(xì)胞免疫特征,可進(jìn)一步滿足將來的研究需要。但原代細(xì)胞培養(yǎng)至P5代基本停止增殖，如何提高細(xì)胞活性及細(xì)胞傳代有待進(jìn)一步探索。

本研究通過合理取材，使用二次酶消化，降低了對細(xì)胞的破壞，一次網(wǎng)篩和差時貼壁純化，在較短的時間內(nèi)獲得了較多的組織細(xì)胞，成功分離和純化了人ESC，為進(jìn)一步研究IUA的發(fā)病機(jī)制及女性不孕不育體外細(xì)胞研究治療奠定了體外細(xì)胞學(xué)水平試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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