曹 輝，許 鐘，白班俊，張玲玲

(貴州省人民醫(yī)院:1.腫瘤科;2.消化內(nèi)科，貴陽 550002)

微小RNA (miRNA)通過使其靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[1]，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理和病理過程，因而受到廣泛關(guān)注。多項(xiàng)研究對胃癌臨床標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，相對于癌旁組織，胃癌中出現(xiàn)多種miRNA表達(dá)的異常上調(diào)或下調(diào)；同時(shí)，miRNA的表達(dá)也受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如P53可誘導(dǎo)miR-34a、miR-26b、miR-92、miR-29a、miR-25、miR-103、miR-128a等一系列miRNA的表達(dá)上調(diào)[2]。對野生型P53胃癌來說，探討P53通過miRNA間接作用參與腫瘤的發(fā)生有助于深入理解該類腫瘤的發(fā)生機(jī)制。本研究擬通過生物信息學(xué)預(yù)測胃癌中P53誘導(dǎo)相關(guān)miRNA的靶基因，并進(jìn)一步對其靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，為后續(xù)的表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1目標(biāo)miRNA的篩選 通過在線人類疾病相關(guān)microRNA數(shù)據(jù)庫mir2disease[3]，檢索胃癌中高表達(dá)的miRNA；用檢索結(jié)果與P53誘導(dǎo)相關(guān)miRNA對比，取交集得到胃癌中P53誘導(dǎo)相關(guān)miRNA。

1.2靶基因的預(yù)測 確定目標(biāo)miRNA后，利用在線預(yù)測軟件miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫miRGen(v3.0)進(jìn)行靶基因預(yù)測(含PicTar、miRanda、DIANA-microT、TargetScanS 等miRNA 靶基因預(yù)測工具)[4]，得到目標(biāo)miRNA的候選靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3確立胃癌中的預(yù)測靶基因 通過在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Gene Expression Atlas[5]檢索獲得胃癌中表達(dá)下調(diào)的基因，用預(yù)測的候選靶基因數(shù)據(jù)集與之比對，獲得胃癌中目標(biāo)miRNA的靶基因數(shù)據(jù)集。

1.4功能富集分析 通過在線軟件DAVID[6]對預(yù)測的靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行功能富集分析；Pathway Miner進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1目標(biāo)miRNA的篩選情況 應(yīng)用在線mir2disease數(shù)據(jù)庫檢索胃癌相關(guān)miRNA，根據(jù)其詳細(xì)注釋篩選出在胃癌中表達(dá)上調(diào)的基因，共18個(gè)；匯總胃癌中高表達(dá)的miRNA與P53誘導(dǎo)相關(guān)miRNA[2]兩者對比，初步獲得本研究候選miRNAs，見圖1。

圖1 目標(biāo)miRNA篩選圖

2.2miR-21靶基因的預(yù)測 從候選目標(biāo)miRNA中選擇文獻(xiàn)報(bào)道較多的miR-21，通過在線軟件預(yù)測其靶基因，用集成常用預(yù)測工具的miRGen(v3)分析，結(jié)果共獲得1 090個(gè)基因。

2.3確立胃癌中的預(yù)測靶基因 應(yīng)用在線基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫Gene Expression Atlas檢索，選擇 “(All genes) and down in gastric carcinoma”，限定為“Homo sapiens”，獲得胃癌中表達(dá)下調(diào)的基因共2 737個(gè)，用預(yù)測的1 090個(gè)候選靶基因數(shù)據(jù)集與之比對，獲得胃癌中目標(biāo)miRNA的靶基因數(shù)據(jù)集共115個(gè)，見表1。

2.4功能富集分析結(jié)果 應(yīng)用DAVID進(jìn)行Gene_Ontology分析時(shí)，選擇系統(tǒng)默認(rèn)的GOTERM_BP_FAT、GOTERM_CC_FAT、GOTERM_MF_FAT 3個(gè)庫，其中P<0.01部分結(jié)果見表2。通過Pathway Miner分析相關(guān)信號通路(表3)，細(xì)胞調(diào)節(jié)通路包括黏附連接、脂肪細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡、鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等，代謝途徑包括賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、丁酸代謝、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝等，見圖2。

表1 胃癌中miR-21的靶基因預(yù)測與篩選結(jié)果

-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

表2 應(yīng)用DAVID進(jìn)行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

續(xù)表2 應(yīng)用DAVID進(jìn)行Gene_Ontology功能富集分析(部分)

表3 Pathway Miner分析中KEGG部分相關(guān)信號通路名稱

圖2 Pathway Miner分析中部分信號通路涉及基因(KEGG)

3 討 論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在胃黏膜癌變過程中，P53等多種抑癌基因的變化參與了胃癌形成。P53和多種轉(zhuǎn)錄因子之間存在著相互作用，但仍難以充分闡明胃癌發(fā)生機(jī)制。近年來發(fā)現(xiàn)P53可影響一組miRNA的表達(dá)[2]，為本研究提供了新的契機(jī)。

miRNA作為一類具有調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA(約18～22 nt)，通過使其靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[1,7]。miRNA通過這種機(jī)制參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理、病理過程。同時(shí)，miRNA的表達(dá)也受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，P53可誘導(dǎo)一系列miRNA的表達(dá)上調(diào)[2]。通過對胃癌臨床標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，胃癌中出現(xiàn)多種miRNA表達(dá)的異常表達(dá)，如mir-34、mir-128a、miR-92、miR-25、miR-103等的上調(diào)，mir-128b、mir-129、mir-148等的下調(diào)[8-10]。正是由于miRNA與轉(zhuǎn)錄因子之間存在相互調(diào)控作用，推測在野生型P53胃癌中，P53可能在誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)后，進(jìn)而通過miRNA對下游基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。因此，作者進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

通過在線數(shù)據(jù)的深度挖掘，成功縮小胃癌中目標(biāo)miRNA分析范圍。miR-21與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望作為胃癌分子標(biāo)志[11]，選擇其進(jìn)一步分析預(yù)測靶基因。經(jīng)過整合常用miR靶基因預(yù)測軟件的靶基因數(shù)據(jù)庫miRGen(v3)進(jìn)行靶基因預(yù)測后，應(yīng)用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫有效縮小靶基因范圍，獲得在胃癌中相關(guān)的預(yù)測靶基因集。應(yīng)用在線軟件DAVID和Pathway Miner分別進(jìn)行GO基因注釋、功能富集分析和信號通路分析。結(jié)果顯示在胃癌中MiR-21的靶基因涉及系列信號通路中，包括黏附連接、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡、鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路[12-13]。

經(jīng)過充分?jǐn)?shù)據(jù)發(fā)掘，利用生物信息學(xué)分析結(jié)果所提供的重點(diǎn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為基礎(chǔ)，可以開展針對性的實(shí)驗(yàn)研究，將有助于進(jìn)一步理解P53、miRNA及下游靶基因組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

[1]Wu L,Fan J,Belasco JG.MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(11):4034-4039.

[2]Tarasov V,Jung P,Verdoodt B,et al.Differential regulation of microRNAs by p53 revealed by massively parallel sequencing:miR-34a is a p53 target that induces apoptosis and G1-arrest [J].Cell Cycle,2007,6(13):1586-1593.

[3]Jiang Q,Wang Y,Hao Y,et al.miR2Disease:a manually curated database for microRNA deregulation in human disease [J].Nucleic Acids Res,2009,37(Database issue):D98-104.

[4]Alexiou P,Vergoulis T,Gleditzsch M,et al.miRGen 2.0:a database of microRNA genomic information and regulation [J].Nucleic Acids Res,2010,38(Database issue):D137-141.

[5]Petryszak R,Burdett T,Fiorelli B,et al.Expression Atlas update——a database of gene and transcript expression from microarray- and sequencing-based functional genomics experiments [J].Nucleic Acids Res,2014,42(1):D926-932.

[6]Huang da W,Sherman BT,Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources [J].Nat Protoc,2009,4(1):44-57.

[7]Zeng Y,Cullen BR.Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells [J].RNA,2003,9(1):112-123.

[8]Volinia S,Calin GA,Liu CG,et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(7):2257-2261.

[9]Tchernitsa O,Kasajima A,Schafer R,et al.Systematic evaluation of the miRNA-ome and its downstream effects on mRNA expression identifies gastric cancer progression [J].J Pathol,2010,222(3):310-319.

[10]Li X,Zhang Y,Zhang H,et al.miRNA-223 promotes gastric cancer invasion and metastasis by targeting tumor suppressor EPB41L3 [J].Mol Cancer Res,2011,9(7):824-833.

[11]Li BS,Zhao YL,Guo G,et al.Plasma microRNAs,miR-223,miR-21 and miR-218,as novel potential biomarkers for gastric cancer detection [J].PLoS One,2012,7(7):e41629.

[12]Souma Y,Nishida T,Serada S,et al.Antiproliferative effect of SOCS-1 through the suppression of STAT3 and p38 MAPK activation in gastric cancer cells [J].Int J Cancer,2012,131(6):1287-1296.

[13]Wei Q,Zhou W,Wang W,et al.Tumor-suppressive functions of leucine zipper transcription factor-like 1[J].Cancer Res,2010,70(7):2942-2950.