陳夢(mèng)潔，馬克濤，2，司軍強(qiáng)，2，3，4，樊 超，李 麗，2△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室,新疆石河子 832002;2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832002;3.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,武漢 430071;4.華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430071)

七氟醚是一種較新的鹵族吸入麻醉劑，與其他麻醉藥物相比，其優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)迅速、刺激性小、溶解度低及較好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，并且吸收和清除迅速，并發(fā)癥少，這些特性使其成為一種理想的吸入性麻醉藥物廣泛應(yīng)用于臨床。但是，吸入性麻醉藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制尚未完全闡明[1]。以往的研究證明吸入性麻醉藥物如氟烷、異氟烷、七氟烷在脊髓水平有明顯的抗傷害感受作用[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)支持麻醉藥物通過(guò)加強(qiáng)抑制性突觸功能而發(fā)揮作用[3]。γ-氨基丁酸(GABA)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，作為最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，在傷害性信息處理或痛覺(jué)調(diào)制中發(fā)揮重要作用，目前已經(jīng)證實(shí)GABA受體主要參與痛覺(jué)的傳遞[4]。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞是軀體感覺(jué)信息的初級(jí)傳入神經(jīng)元，在疼痛的發(fā)生和維持中起著重要的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)擬用膜片鉗技術(shù)在DRG細(xì)胞上檢測(cè)七氟醚對(duì)GABA激活電流的影響，探討七氟醚在初級(jí)感覺(jué)突觸前(脊髓)發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選用4周齡SD大鼠(150～200 g)，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、GABA、HEPES 為 Sigma公司產(chǎn)品。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。Axon 700B放大器(美國(guó)Axon公司)、P-97拉制儀(美國(guó)Sutter公司)、生物電信號(hào)記錄計(jì)算機(jī)(Axoscope 10.2 軟件，美國(guó)Axon公司)。

1.2 方法 將大鼠擊昏、斷頭后迅速切開(kāi)背部皮膚，沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨及軟組織，取出頸、胸、腰段脊柱。由脊柱正中縱向剖成兩半，置于細(xì)胞外液中，外液成分(mmol/L)：NaCl 150、KCl 5、CaCl22.5、MgCl21、HEPES 10、D-glucose 10，NaOH調(diào)節(jié)pH為7.3～7.4，溶液滲透壓為330 mOsm。由剖開(kāi)的椎管內(nèi)側(cè)棄去脊髓，逐個(gè)取出神經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)根，在顯微鏡下用精細(xì)角膜剪和游絲鑷子剪除相連的神經(jīng)根和周圍的結(jié)締組織被膜，將修剪干凈的DRG剪碎成2～3塊，轉(zhuǎn)移到加有胰蛋白酶0.25 mg/mL、膠原酶0.5 mg/mL的EP管中，置于37 ℃的恒溫恒濕箱內(nèi)15 min。取出放入少量的胰蛋白酶抑制劑終止其繼續(xù)消化。將上述機(jī)械分離和酶處理的DRG神經(jīng)元進(jìn)行離心(1 000 r/min離心 6 min)，棄去上清液，采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)將DRG細(xì)胞外液移入沉淀中，吹打使其分散后移入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入細(xì)胞外液，在室溫靜置至少30 min，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。

使用Axon 700B放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄，記錄電極尖端直徑約為1 μm，電極阻抗約為3～5 Mμ，由P-97拉制儀二步拉制，電極充灌內(nèi)液成分(mmol/L)：KCl 140、CaCl21、MgCl22、HEPES 10、EGTA 11，KOH調(diào)節(jié)pH為7.3～7.4。實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下，選用分離的單個(gè)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，貼壁良好、輪廓及形態(tài)清晰、胞膜完整有光暈、折光性強(qiáng)且胞質(zhì)均勻的中小細(xì)胞，細(xì)胞直徑15～45 μm。通過(guò)微操縱器將玻璃微電極移至細(xì)胞表面后給予負(fù)壓吸引，電極與細(xì)胞膜形成高阻(>1 GΩ)封接后將膜吸破，然后調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻保持電壓為-60 mV，膜電流應(yīng)用低通濾波(10 Hz)。

藥物均用無(wú)糖外液配制，七氟醚在實(shí)驗(yàn)前30 min之內(nèi)配置，給藥系統(tǒng)為密閉的，通過(guò)微操縱器移動(dòng)快速換液裝置的排藥管進(jìn)行，排藥管每管的直徑為0.5 mm，管口距所記錄的細(xì)胞100 μm，實(shí)驗(yàn)在室溫20～30 ℃進(jìn)行。細(xì)胞外灌流GABA給藥順序由低濃度到高濃度依次進(jìn)行，給藥時(shí)間為5～6 s，給藥間歇為4 min，給藥間歇用細(xì)胞外液沖洗。給七氟醚混合液時(shí)，同上先灌流相同濃度的GABA引出電流作為前對(duì)照，待IGABA穩(wěn)定后，洗脫4 min后持續(xù)預(yù)灌流七氟醚10 s，然后灌流5 s GABA和七氟醚的混合液，洗脫至IGABA恢復(fù)到前對(duì)照水平后，灌流另一濃度的七氟醚。記錄不同濃度七氟醚對(duì)IGABA的增強(qiáng)作用，并計(jì)算七氟醚對(duì)IGABA的增強(qiáng)率=(I混合-IGABA)÷IGABA×100% 。

2 結(jié) 果

2.1 DRG細(xì)胞GABA激活電流 實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了106個(gè)細(xì)胞，其中大多數(shù)(86.8%，92/106)對(duì)GABA敏感。GABA(1～1000 μmol/L)激活的內(nèi)向電流具有明顯去敏感性，且具有濃度依賴性(P<0.05,n=6)，見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證此反應(yīng)可被GABAA受體特異性激動(dòng)劑蠅蕈醇(100 μmol/L)模擬，被GABAA受體選擇性拮抗劑荷包牡丹堿(100 μmol/L)阻斷(圖2)[6]。提示GABA激活的內(nèi)向電流由GABAA受體所介導(dǎo)。

2.2 七氟醚對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用 預(yù)灌流七氟醚(30～3 000 μmol/L)10 s后對(duì)GABA(10～100 μmol/L)激活電流產(chǎn)生明顯的調(diào)制作用，在92個(gè)對(duì)GABA反應(yīng)敏感的神經(jīng)元中：七氟醚對(duì)其中81個(gè)神經(jīng)元(88.04%，81/92)膜上GABA激活電流產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)；對(duì)2個(gè)神經(jīng)元(2.17%，2/92)無(wú)明顯作用；對(duì)11個(gè)神經(jīng)元(11.96%，11/92)呈現(xiàn)抑制作用。其中還發(fā)現(xiàn)在61.96%(57/92)的DRG神經(jīng)元膜上，當(dāng)七氟醚的濃度為300～3 000 μmol/L時(shí)可引起一個(gè)外向電流(見(jiàn)圖3)。

2.2.1 七氟醚非濃度依賴性的增強(qiáng)GABA(100 μmol/L)激活電流 預(yù)灌流七氟醚(30～3 000 μmol/L)對(duì)GABA(100 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)作用與七氟醚呈非濃度依賴性，七氟醚的濃度為100～3 000 μmol/L時(shí)對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=6),當(dāng)七氟醚的濃度分別為100、300、1 000、3 000 μmol/L時(shí)對(duì)GABA(100 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)率分別為34.17%±4.85%、44.25%±9.48%、41.42%±7.26%、18.98%±0.67%，可以看出當(dāng)七氟醚濃度為300 μmol/L時(shí)對(duì)GABA(100 μmol/L)激活電流增強(qiáng)作用最明顯(P<0.05,n=6),見(jiàn)圖3。

圖1 GABA激活的濃度依賴性的內(nèi)向電流

圖2 荷包牡丹堿對(duì)GABA激活內(nèi)向電流的影響

A：不同濃度七氟醚對(duì)100 μmol/L GABA激活電流的增強(qiáng)率。與30 μmol/L組比較，*P<0.05；與300 μmol/L組比較，#P<0.05；與1 000 μmol/L組比較，&P<0.05；與300 μmol/L組比較，&P<0.05。B：不同濃度七氟醚對(duì)100 μmol/L GABA激活電流的增強(qiáng)比值。與control組比較，*P<0.05；與30 μmol/L組比較，#P<0.05 ；與100 μmol/L組比較，△P<0.05。

圖3 七氟醚對(duì)100 μmol/L GABA激活電流的增強(qiáng)作用

2.2.2 七氟醚對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用與GABA呈濃度依賴性 預(yù)灌流100、300、1000 μmol/L七氟醚對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用與GABA呈濃度依賴性(圖4)，七氟醚對(duì)較小濃度的GABA(10 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)率最大，即增強(qiáng)作用最明顯(P<0.05,n=6)，當(dāng)七氟醚的濃度為100、300、1 000 μmol/L時(shí)對(duì)GABA(10 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)率分別達(dá)124.63%±22.87%、186.88%±30.69%、153.65%±28.94%。可以看出當(dāng)七氟醚的濃度為300 μmol/L時(shí)對(duì)GABA(10～100 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)作用最明顯(P<0.05,n=6)，見(jiàn)圖4。

*:P<0.05,與100 μmol/L組比較，；#:P<0.05,與50 μmol/L組比較。

圖4 不同濃度的七氟醚對(duì)不同濃度的GABA激活電流的增強(qiáng)作用

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的七氟醚(100～3 000 μmol/L)均能增強(qiáng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞GABA激活的電流，當(dāng)七氟醚濃度為300 μmol/L時(shí)增強(qiáng)作用最明顯，達(dá)44.25%±9.48%。七氟醚對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用與GABA呈濃度依賴性，對(duì)較小濃度的GABA(10 μmol/L)激活電流的增強(qiáng)作用最明顯，其中300 μmol/L的七氟醚對(duì)10 μmol/L GABA激活電流的增強(qiáng)率為186.88%±30.69%。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，它在脊髓背角通過(guò)突觸前抑制作用，減少初級(jí)傳入神經(jīng)末梢興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，即“突觸前抑制”[7]。當(dāng)GABA的濃度越低時(shí)，GABA能系統(tǒng)在初級(jí)感覺(jué)傳入終末產(chǎn)生的突觸前抑制作用越弱，而本實(shí)驗(yàn)中七氟醚對(duì)較低濃度GABA激活電流的增強(qiáng)作用較明顯，可能的原因是七氟醚可以通過(guò)增強(qiáng)GABA對(duì)GABA受體的親和力，來(lái)發(fā)揮抗傷害的作用。羅愛(ài)林等[8]證明當(dāng)七氟醚的濃度超過(guò)3 000 μmol/L時(shí)，GABA激活電流的峰值會(huì)下降，這可能與部分阻塞氯通道有關(guān)，因此，本次試驗(yàn)采用七氟醚的濃度為30～3 000 μmol/L。GABAA受體復(fù)合物是一個(gè)多亞基配體門(mén)控的離子通道，一些藥物可以作用于GABAA受體復(fù)合物而產(chǎn)生類似GABA反應(yīng)發(fā)揮作用，例如巴比妥類、苯二氮卓類、類固醇類和異丙酚類等藥物。有研究證明，七氟醚在海馬神經(jīng)元可引起一種內(nèi)向電流，而且該電流可被荷包牡丹堿阻斷，這表明該電流和GABAA受體有關(guān)[9]。還有一些全身麻醉藥物可通過(guò)增加該受體復(fù)合物中氯通道的平均開(kāi)放時(shí)間或開(kāi)放頻率而增強(qiáng)GABA作用[10]。并且Jones等[10]還證明3種吸入性麻醉藥物(氟烷、恩氟烷、異氟烷)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上可加強(qiáng)GABA激活的氯電流。Wu等[11]推斷GABAA受體上似乎存在一個(gè)對(duì)于許多吸入麻醉藥的結(jié)合位點(diǎn)，而臨床濃度的七氟醚所通過(guò)的結(jié)合位點(diǎn)和苯巴比妥或地西泮是不同的。另外徐宏偉等[12]采用放射配體結(jié)合分析法，進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)及飽和實(shí)驗(yàn)，也進(jìn)一步證實(shí)七氟醚可提高GABA與GABAA受體的親和力，但不影響GABA的結(jié)合位點(diǎn)。

在臨床麻醉中根據(jù)患者的年齡和麻醉方法的不同，七氟醚的最低肺泡有效濃度(minimumalveolar concentration,MAC)為1.48%～2.03%，相應(yīng)的血藥濃度是340～470 μmol/L，本實(shí)驗(yàn)中接近這個(gè)濃度的七氟醚濃度是300 μmol/L，臨床上MAC的七氟醚(680～940 μmol/L)可以作為惟一使用的麻醉藥誘導(dǎo)后氣管內(nèi)插管，這和本次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的1 000 μmol/L的七氟醚很接近，但由于在手術(shù)室中七氟醚很少單獨(dú)使用，通常七氟醚是混合著氧氣一起使用，這會(huì)使七氟醚實(shí)際進(jìn)入血液的濃度降低，所以在臨床中七氟醚經(jīng)常使用的濃度和本次試驗(yàn)中對(duì)GABA激活電流的增強(qiáng)作用最明顯的七氟醚濃度是十分接近的。

本實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗技術(shù)在DRG細(xì)胞上檢測(cè)到七氟醚對(duì)GABA激活的電流有增強(qiáng)作用，當(dāng)GABA濃度越低時(shí)GABA能系統(tǒng)在初級(jí)感覺(jué)傳入終末產(chǎn)生的突觸前抑制作用越弱，而七氟醚卻對(duì)較低濃度的GABA激活電流的增強(qiáng)作用最明顯，這可以部分解釋七氟醚在初級(jí)感覺(jué)突觸前(脊髓)發(fā)揮麻醉作用的可能機(jī)制。

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