孫 波，江玲麗

（1.國(guó)家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316021）

鱉源凡隆氣單胞菌分離株對(duì)稚鱉的致病力

孫 波1，江玲麗2

（1.國(guó)家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316021）

從發(fā)病中華鱉分離得到2株細(xì)菌，經(jīng)Vitek生化反應(yīng)鑒定為凡隆氣單胞菌（Aeromonasυeronii）。通過稚鱉致病力試驗(yàn)與毒力基因分析評(píng)估細(xì)菌的毒力風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明，2株凡隆氣單胞菌分離株均對(duì)稚鱉具有較強(qiáng)的毒力，在24～48 h達(dá)到死亡高峰，半數(shù)致死量（LD50）分別為6.17與6.05；其肝臟細(xì)菌增殖曲線與死亡變化相符，于24～48 h達(dá)到峰值（105g-1）。分離株的毒力基因型為aerA+act+alt+ast-。

中華鱉；凡隆氣單胞菌；致病力；毒力基因

中華鱉（Trionyχsinens）隸屬爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的名優(yōu)產(chǎn)品。中華鱉在我國(guó)分布廣泛，除新疆、西藏和青海外，其他各省均有生產(chǎn)。浙江省作為我國(guó)中華鱉養(yǎng)殖的主產(chǎn)區(qū)，2012年養(yǎng)鱉產(chǎn)量逾15萬t，產(chǎn)值約70億元，約占全國(guó)50%［1-2］。

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大與集約化程度的提高，中華鱉病害發(fā)生率不斷上升，且常呈現(xiàn)暴發(fā)流行，給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，影響了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。先前的研究顯示，細(xì)菌性病原是引起中華鱉發(fā)病最重要的微生物性因素之一［3-7］。氣單胞菌屬（Aeromonas）細(xì)菌是引起中華鱉暴發(fā)性死亡的主要病原，也是中華鱉細(xì)菌性疾病中引起經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的致病菌［2，6-7］。其中致病性氣單胞菌主要包括嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）與凡隆氣單胞菌（A.υeronii）［2，8］。這兩種氣單胞菌均為人獸魚共患病原菌，對(duì)人類健康與公共衛(wèi)生存在較大的隱患。鱉源嗜水氣單胞菌的致病力研究相對(duì)較多，已證實(shí)其對(duì)稚鱉具有較高的致病力［9-10］；而凡隆氣單胞菌對(duì)稚鱉的致病力研究則鮮見報(bào)道。因此，本研究針對(duì)2株采自浙江省發(fā)病中華鱉的凡隆氣單胞菌分離株，進(jìn)行種別鑒定，并通過稚鱉攻毒試驗(yàn)與毒力基因分析評(píng)估其毒力風(fēng)險(xiǎn)，旨在為中華鱉氣單胞菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌鑒定

兩株凡隆氣單胞菌分別分離自2批次發(fā)生大規(guī)模死亡的中華鱉瀕死個(gè)體，分別命名為B1與B2。分離株接種于腦心浸液培養(yǎng)基（BHⅠ，青島海博生物技術(shù)有限公司），28℃振蕩培養(yǎng)。經(jīng)革蘭氏染色，在油鏡下判定其為革蘭氏陽性或陰性；據(jù)此選擇相應(yīng)的生化測(cè)定卡，應(yīng)用全自動(dòng)微生物分析儀（Vitek 2 Compact，Biomerieux，F(xiàn)rance）測(cè)定細(xì)菌的46個(gè)生化指標(biāo)，與數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行比對(duì)以確定菌種。

1.2 細(xì)菌對(duì)稚鱉致病力測(cè)定

1.2.1 細(xì)菌半數(shù)致死量

將270只（12±2）g的健康稚鱉隨機(jī)分為9組，每組30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后備用。飼養(yǎng)用水為經(jīng)48 h自然曝氣的自來水，水溫控制在28℃，pH值7.1，水質(zhì)符合NY 5051-2001無公害食品淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)要求。

分離株B1與B2接種于BHⅠ培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水（0.85%NaCl）將菌液倍比稀釋成106，107，108，109m L-1的梯度菌懸液，對(duì)8組稚鱉進(jìn)行菌液腹腔注射，注射部位為后肢近上方的腹面空腔，每只注射0.1 m L，折合實(shí)際注射濃度為105，106，107，108只-1；同時(shí)對(duì)陰性對(duì)照組（CK）稚鱉注射等體積的無菌生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，記錄其死亡情況；同時(shí)對(duì)瀕死中華鱉的肝、腎進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。根據(jù)修正的斯皮爾曼-卡伯分析方法，計(jì)算各菌株半數(shù)致死量（LD50）［11］。

1.2.2 肝臟細(xì)菌含量

將90只（12±2）g的健康稚鱉隨機(jī)分為3組，每組30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后備用。飼養(yǎng)用水同1.2.1節(jié)所述。分別腹腔注射實(shí)際濃度106只-1的B1與B2菌液至1組稚鱉，同時(shí)以等體積的無菌生理鹽水注射陰性對(duì)照組稚鱉。分別于注射后4，24，48，72，96，120 h，每組每次剖取3只稚鱉，對(duì)肝臟細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.3 毒力基因測(cè)定

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取細(xì)菌基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。?yīng)用PCR技術(shù)測(cè)定氣單胞菌4個(gè)主要毒力基因，包括氣溶素（aerA）與3種重要腸毒素，即細(xì)胞毒性腸毒素（act）、不耐熱細(xì)胞緊張性腸毒素（alt）、耐熱細(xì)胞緊張性腸毒素（ast）［12］（表1）。為驗(yàn)證PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，每個(gè)基因均隨機(jī)選取20%的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)。

PCR反應(yīng)采用25μL反應(yīng)體系：10×Taq Buffer（含Mg2+）3μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 0.6μL，50μmol·L-1上下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，Taq DNA polymerase 0.3μL，加雙蒸水補(bǔ)足體積。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸時(shí)間按1 000 bp· min-1計(jì)算，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。目的基因、引物序列及退火溫度參見表1。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)Goldview染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。產(chǎn)物回收純化后送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列與擴(kuò)增長(zhǎng)度

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌鑒定

分離株B1與B2的菌落微白、光滑、半透明。經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陰性菌。基于Vitek測(cè)定的46個(gè)生化反應(yīng)結(jié)果，B1與B2均為凡隆氣單胞菌，置信度達(dá)99%。

2.2 細(xì)菌對(duì)稚鱉的致病力

凡隆氣單胞菌分離株B1與B2對(duì)稚鱉呈現(xiàn)相似的致死規(guī)律：108組在注射后4 h出現(xiàn)死亡，在24 h達(dá)死亡高峰，并在48 h內(nèi)全部死亡；107組亦在注射后4 h出現(xiàn)死亡，在24～48 h出現(xiàn)死亡高峰，并在72 h內(nèi)全部死亡；106組在注射后28 h出現(xiàn)死亡，并在24～96 h持續(xù)死亡，累積死亡個(gè)體占攻毒個(gè)體的50%～70%；105組僅有1只稚鱉死亡（表2）。剖檢死亡個(gè)體的肝、腎，均分離得到與原注射菌菌落形態(tài)一致的細(xì)菌，并經(jīng)Vitek判定為凡隆氣單胞菌?；谛拚乃蛊柭?卡伯分析方法，B1與B2的半數(shù)致死量（LD50）分別為6.17與6.05（表2）。

與上述死亡變化相符，106組稚鱉的肝臟細(xì)菌含量在24～48 h達(dá)到高峰（達(dá)105g-1），之后持續(xù)下降（圖1）。綜上所述，分離株B1與B2均對(duì)稚鱉具有較強(qiáng)的致病力。

圖1 攻毒后稚鱉肝臟細(xì)菌含量測(cè)定

2.3 細(xì)菌毒力基因

分離得到的2株凡隆氣單胞菌株均含有aerA，act，alt基因，而缺失ast（表3）。與其他4組已報(bào)道的鱉源氣單胞菌比較，安徽與江蘇分離株的aerA陽性率分別為83%與75%，其余3組則均為陽性；本研究與廣西分離株的act陽性率均為100%；但廣西分離株的alt陽性率為77%，而本研究與安徽分離株則均為100%；本研究的ast陽性率為0，其余4組鱉源氣單胞菌則未檢測(cè)該基因。由此可見，鱉源氣單胞菌的aerA，act，alt陽性率較高；本研究分離株B1與B2的毒力基因型為aerA+act+alt+ast-，其aerA與alt陽性率高于其他組的平均水平。

表2 凡隆氣單胞菌分離株B1與B2對(duì)稚鱉的毒力測(cè)定

表3 鱉源氣單胞菌毒力基因型比較

3 小結(jié)

本研究從兩批次浙江瀕死中華鱉中分離得到2株凡隆氣單胞菌B1與B2，所分離到的B1與B2菌株對(duì)稚鱉具有較強(qiáng)的毒力，其毒力基因型為aerA+act+alt+ast-。強(qiáng)致病性的凡隆氣單胞菌對(duì)水生動(dòng)物健康與水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成極大的隱患，亟需建立針對(duì)致病性氣單胞菌的監(jiān)測(cè)體系，以期為病害防控提供科學(xué)依據(jù)，保障中華鱉產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：高 峻）

S 96

A

0528-9017（2014）06-0936-03

文獻(xiàn)著錄格式：孫波，江玲麗.鱉源凡隆氣單胞菌分離株對(duì)稚鱉的致病力［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（6）：936-939.

2014-02-19

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008C33049）

孫 波（1976-），男，浙江杭州人，研究方向?yàn)樯锕こ碳八幚黹_發(fā)。E-mail：ppgsunbo@163.com。

江玲麗。E-mail：allan_523@163.com。