目的觀察三七總皂苷（PNS）對人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞的增殖、凋亡及Caspase-3表達的影響。方法用不同濃度PNS作用于U937細胞，采用MTT法檢測細胞增殖活性，用流式細胞術檢測細胞周期和凋亡，Western-blot法檢測Caspase-3蛋白表達。結(jié)果PNS抑制U943細胞生長并呈時間和劑量依賴性；分別予100、200、400、800mg/L處理U937細胞48h，細胞凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細胞凋亡率為（1.73±1.50）%（P＜0.01），并誘導細胞G1期阻滯；Western-blot結(jié)果顯示，PNS使Caspase-3蛋白表達上調(diào)。結(jié)論PNS能抑制U937細胞增殖，并可能通過上調(diào)Caspase-3蛋白表達誘導細胞凋亡。

三七總皂苷；U937細胞；凋亡；Caspase-3

三七總皂苷（panax notoginseng saponis，PNS）是從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀，活絡通脈等功效。近年來，許多實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)，PNS對肝癌、胃癌、前列腺癌、婦科腫瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤具有抗腫瘤作用[1-5]。但PNS對人急性單核細胞白血病的研究資料甚少。本文采用不同濃度PNS作用于人急性單核細胞白血病細胞系U937，觀察其對U937細胞增殖及凋亡的影響，為進一步研究PNS抗白血病作用提供實驗依據(jù)，旨在擴展急性髓性白血病的輔助治療方法。

1 實驗材料

1.1藥物及材料 人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞由本實驗室保存；PNS凍干粉針劑購自廣西梧州制藥有限公司；IMDM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（DSMO）、四甲基偶氨唑藍（MTT）購自Sigma公司；細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自Invitrogen公司；一抗購自Santa Crusz公司。

1.2主要儀器及設備 二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），酶標儀（BioTek，ELx808IU），流式細胞儀（BD），電泳槽、電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 將U937細胞接種于含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2分 組 設實驗組和空白對照組。PNS按劑量不同分為50、100、200、400、800、1600、3200mg/L七組，未加藥組為對照組。

2.3細胞生長抑制率測定 采用噻唑藍（MTT）還原法進行檢測。將1×105/mL濃度的U937細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL，每組設6個平行孔。分別作用于24、48、72h后，加入MTT（濃度5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μL，在自動酶標儀上進行比色（測試波長490nm），自動記錄每孔吸光度（D）值，計算不同濃度PNS對U937細胞的生長抑制率：抑制率（%）=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。

2.4流式細胞術（FCM）檢測細胞周期和凋亡率

收集U937細胞，離心1000rpm，5min，去培養(yǎng)基，冷PBS洗滌1次。用1×Annexin-binding buffer重懸細胞約1×106/mL，取100uL，加5μL Annexin V和1μL 100μg/mL PI，室溫5min，加400μL1×Annexin-binding buffer，輕輕混勻，放于冰上，進行FCM分析。

2.5Western-blot法檢測Caspase-3蛋白 收集細胞，PBS洗滌，抽提細胞裂解液。蛋白上樣量40μg，SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移，1%BSA封閉，1h。一抗1：1000稀釋，1.5h；二抗1：8000稀釋，1h，ECL顯影。

2.6統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用（） 表示，應用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1PNS對U937細胞增殖的影響 PNS對U937細胞的生長有明顯的抑制作用，并且隨濃度增加，作用時間延長，細胞抑制率明顯升高（P＜0.05）。不同濃度PNS作用于U937細胞48h，隨著PNS濃度增加抑制率增加，100mg/L以上濃度可明顯抑制U937細胞增殖（P＜0.01），見表1。

表1 PNS對U937細胞增殖的影響（n=3，）

表1 PNS對U937細胞增殖的影響（n=3，）

注：與對照組比較，*P＜0.01

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3.2PNS對U937細胞周期和凋亡的影響 分別用100、200、400、800mg/L的PNS處理U937細胞48h后，誘導細胞G1期阻滯，停留于G1期的細胞增加，并誘導細胞凋亡，凋亡率分別為（5.93±0.15）%、（7.43±0.70）%、（12.3±0.38）%和（20.4±0.91）%，對照組細胞凋亡率為(1.73±1.50%)（P＜0.01），呈劑量依賴性方式，見表2，圖1（封二）。

表2 不同濃度PNS作用于U937細胞后細胞周期分布（n=3，） %

表2 不同濃度PNS作用于U937細胞后細胞周期分布（n=3，） %

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3.3PNS對U937細胞Caspase-3蛋白表達的影響

用不同濃度PNS作用于U937細胞72h，Caspase-3蛋白的表達隨濃度增加逐漸上調(diào)，見圖2（封二）。

4 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡調(diào)控和細胞增殖調(diào)控紊亂密切相關。細胞凋亡即程序性細胞死亡，主要有線粒體途徑、死亡受體介導途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導途徑。這三條途徑最終都會激活Caspase-3，Caspase-3是細胞凋亡反應中的執(zhí)行者和關鍵酶，直接參與介導細胞凋亡過程[6]。通過活化脫氧核糖核酸酶，引起細胞染色體斷裂，發(fā)生細胞凋亡[7]。Caspase-3是真核細胞中的凋亡蛋白，屬半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，大多數(shù)的細胞凋亡與之相關[8]。

PNS是中藥三七的主要成分，廣泛應用于心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗衰老等方面[8-10]。近年來，隨著國內(nèi)外學者不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)PNS具有多靶點抗腫瘤作用，可通過抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡和分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、增強機體免疫功能等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用[11-13]。

本實驗用PNS作用于人急性單核細胞白血病細胞系U937細胞，實驗結(jié)果顯示，PNS可以有效抑制U937細胞增殖，細胞生長抑制作用隨濃度增加及作用時間增加而增強。細胞周期分析顯示，PNS可以使G1期細胞含量較對照組增高，顯示G1期阻滯，并呈濃度依賴性。同時，PNS作用于U937細胞48h后，與對照組比較，100、200、400、800mg/L組均可顯著誘導U937細胞的凋亡。PNS可以使U937細胞Caspase-3蛋白表達增強，并且隨濃度增加蛋白表達增強。

本研究結(jié)果表明，PNS具抑制U937細胞增殖的作用，呈時間和濃度依賴性，并能夠影響細胞周期，阻滯U937細胞于G1期，使Caspase-3蛋白表達增強，誘導細胞凋亡。

［1］程馥艷，劉錫文，徐曉武.三七總皂苷對人肝癌細胞HepG2移植瘤增殖的影響及其機制的研究［J］.河北醫(yī)科大學學報，2011，32（4）：477-449.

［2］李軍祥，王志斌，朱陵群，等.三七提取物對MNNG轉(zhuǎn)化后GES-1細胞的促凋亡作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2005，3（2）：123-127.

［3］劉麗麗，劉艷娥，房國濤.三七總皂苷逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞MCF-7/ADM多藥耐藥的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（4）：954-956.

［4］楊芬，劉浩，余美玲，等.三七粉對小鼠S180移植腫瘤的抑制作用及免疫功能的影響［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2009，34（3）：195-197.

［5］Zhou P，Chou J，Olea RS，et al.Solution structure of Apaf-1 CARD and its interaction with Caspase-9 CARD：a structural basis for specific adaptor/Caspase interaction［J］.Proc Natl Acad Sci，1999，96（6）：11265-11270.

［6］Cahen GM.Caspases：The executioners of apoptosis［J］.Biochem J，1997，326（1）：1-16.

［7］張劍峰，張丹參.三七總皂苷藥理作用研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2007，13（6）：472-474.

［8］張玉軍.三七總皂苷的藥理研究進展［J］.廣西醫(yī)學，2009，31（4）：589-590.

［9］萬曉青.三七及其制劑在心血管疾病的應用［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，18（12）：776-777.

［10］周小寶.三七皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及相關基因表達的影響［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19（1）：15-17

［11］張翠玲，余美玲，陶亮，等.三七總皂苷對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2008，24（4）：254-256.

［12］Morjani H，Madoulet C.Immunosuppressors as multidrug resistance reversal agents［J］.Methods Mol Biol，2010，596（6）：433-446.

［13］Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:clinical studies of p-glycoprotein inhibitors［J］.Methods Mol Biol，2010，596（6）：341-358.

三七總皂苷誘導U937細胞凋亡及對Caspase-3表達的影響

王 瀟 陳小紅 尹利明 高瑞蘭 浙江省中醫(yī)院 杭州310006

Effect of Panax Notoginseng Saponis on Apoptosis of and Caspase-3 in U937 cells

WANG Xiao，CHEN Xiaohong，YIN Liming，GAO Ruilan.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponis（PNS）on proliferation and apoptosis of human acute monocytic leukemia cell line U937 and the expression of caspase-3 in it.MethodsU937 cells were treated with PNS at different concentrations.Cell proliferation was analyzed by MTT assay.Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry,and the expression of Caspase-3 protein was detected by Western blot.ResultsThe inhibition of cell proliferation in U937 cells exposed to PNS was in a dose and time dependent manner.At 48 hours after exposure to 100，200，400，800 mg/L PNS，the apoptotic rates of U937 cells were（5.93± 0.15）%，（7.43±0.70）%，（12.3±0.38）%and（20.4±0.91）%，respectively，which were markedly higher than that of control group（1.73±1.50%，P＜0.01）.The exposure to PNS induced the G1 phase arrest of U937 cells and up-regulated the expression of Caspase-3 protein in U937 cells.ConclusionPNS can inhibit the proliferation of U937 cells and induce apoptosis by up-regulating the expression of Caspase-3.

panax notoginseng saponis；U937 cells；apoptosis；Caspase-3

2013-12-23

2014-02-13

·臨床報道·