張 奇 王 琛

microRNA-21調控TGF-β通路促進增生性瘢痕形成的機制研究

張 奇 王 琛

目的探討microRNA-21在增生性瘢痕（Hypertrophic scars，HS）形成中的作用及機制，為生物學防治提供新靶點。方法收集臨床患者正常皮膚及HS標本，組織學檢測、組織膠原定量檢測；免疫組化、Real-time PCR檢測正常細胞外基質Col 1 A1、Col 3 A1、Fibronectin（FN）及α-SMA的表達；Real-time PCR檢測microRNA-21 mRNA表達水平；培養(yǎng)HS成纖維細胞，構建microRNA-21反義表達載體，并加入TGF-β誘導，Real-time PCR檢測Col 1 A1、Col 3 A1及microRNA-21的表達。結果HS中膠原的含量及細胞外基質表達明顯高于正常皮膚；HS組織中microRNA-21表達高于正常皮膚組織；TGF-β可增強HS成纖維細胞中microRNA-21的表達，而瘢痕成纖維細胞轉染microRNA-21反義表達載體后可明顯降低瘢痕相關基因的表達。結論皮膚創(chuàng)傷愈合后局部microRNA-21表達升高，促進了細胞外基質的合成，而TGF-β進一步加強了microRNA-21對瘢痕形成的促進作用，可能是導致HS形成的重要原因。

增生性瘢痕細胞外基質轉化生長因子小分子核糖核酸

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）是一種皮膚纖維增生性疾病，通常由熱損傷或外傷傷及皮膚深層引起，主要病理特征是微血管的過度增生及膠原蛋白和其他細胞外基質的過度積聚和紊亂排列，一般經歷增生期、穩(wěn)定期、消退期三個階段[1-3]。但具體發(fā)病機制目前仍不清楚，使增生性瘢痕的預防和治療仍面臨著諸多困難。目前雖有許多治療方法，如壓力治療、注射類固醇激素、皮膚移植和手術切除等[4]，但仍未對增生性瘢痕的治療模式達成普遍共識[5]。

microRNA是一種長約19～22 nt的非編碼RNA，屬于短ncRNA家族[6]，它結合到靶基因的3′非翻譯區(qū)，從而抑制靶基因的翻譯和/或誘導靶基因的mRNA降解[7]。microRNAs在許多重要的生物過程中發(fā)揮著重要作用，如細胞生長、增殖、分化，凋亡等[8-9]。最近，一些microRNAs被報道參與纖維化過程中的ECM代謝。在心衰、間質纖維化和心肌肥厚的成纖維細胞中，microRNA-21的表達選擇性地增加[10]，而microRNA-21的表達量失調可能與肺纖維化病變中的多個關鍵信號事件有關[7]。

作為纖維化疾病的一種新的治療方法，基因干擾治療已開始嘗試應用，特別是反義鏈拮抗內源性高表達microRNA的使用[11]。研究證明，抑制microRNA-21的表達能夠降低博萊霉素誘導的小鼠肺部間質纖維化的病變程度[7]。因此，microRNA在纖維化疾病中具有重要的作用，作為基因治療的新靶點越來越多地引起了人們的注意。然而，在增生性瘢痕組織中，microRNA的調控機制和功能仍不太清楚。另外，TGF-β已被證實在膠原蛋白的生成和沉積中有著重要作用[12]。因此，明確在纖維化疾病的發(fā)病過程中特定的microRNA的作用（特別是TGF-β信號通路中），將有助于更清楚地了解增生性瘢痕的發(fā)病機制。本實驗選擇HS形成3～9個月為研究時段，從microRNA水平探索增生性瘢痕的基因治療新方法。

1 材料與方法

1.1 標本的獲取

實驗標本均取自于2013年6月至2014年2月間，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科病房手術的患者，共9例。年齡3～9歲，男女不限，均為胸腹部或四肢燙傷/燒傷后的增生性瘢痕，面積62.5～210.2 cm2，病程3～9個月，術前均未接受任何治療。瘢痕符合POSAS的評估分類標準[13-14]，并進一步確認為增生期瘢痕，POSAS評分42～52。

1.2 主要實驗試劑

HG-DMEM、LG-DMEM（Gibco公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；Ⅳ型膠原酶（Washington Biochemical公司，美國）；TGF-β1（Sigma公司，美國）；鼠抗兔Ⅱ型膠原單克隆抗體（Calbiochem公司，德國）；TRIZOL液（Invitrogen公司，美國）；TaKaRa RNA PCR Kit（Biotech公司，美國）；羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；單克隆兔抗人α-SM-actin、單克隆兔抗人Fn、單克隆兔抗人COL 1 A1、單克隆兔抗人COL 3 A1（Abcam公司，美國）。

TE300型倒置相差顯微鏡、Y-FL型熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織膠原含量的測定

精確稱取瘢痕組織濕重30～100 mg放入試管中，加入水解液約1 mL，混勻。放試管中加蓋后95℃或者沸水浴中水解20 min；調節(jié)pH值至6.0～6.8左右；再加水至5 mL，最后取1 mL測定羥脯氨酸（Hyp）含量，按下式計算Hyp百分含量，再按Grant的方法計算膠原百分含量[15]。

1.3.2 HE染色

切片經梯度二甲苯溶液脫蠟，梯度乙醇溶液脫水；蒸餾水沖洗30 min；蘇木精染色2 min；1%鹽酸乙醇3～5 sec；水洗10～30 sec；0.5%伊紅染色3～5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹膠封固。

1.3.3 Masson染色

石蠟切片脫蠟至水，流水沖洗；蘇木精染核2 min；鹽酸乙醇分化，流水沖洗；麗春紅酸性復紅液染色5～10 min；2%冰醋酸溶液浸洗片刻；1%磷鉬酸溶液分化3 min；直接用苯胺藍或亮綠溶液染色5 min；0.2%冰醋酸浸洗片刻；梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.4 免疫組化

石蠟切片放置在60℃恒溫箱中烘烤120 min；脫蠟和水化：二甲苯20 min→二甲苯20 min→無水乙醇5 min×2次→95%乙醇5 min×2次→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min；PBS洗2次，各5 min，蒸餾水沖洗1次5 min；加3%H2O2溶液孵育10 min（室溫），PBS洗5 min；抗原修復：胰蛋白酶或胃蛋白酶溶液浸洗30 min（37℃）；PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封閉，室溫孵育30 min，傾去，勿洗；滴加一抗，37℃孵育2～3 h，或4℃過夜；PBS沖洗3次，各5 min；加二抗，37℃孵育30 min；PBS洗3次，各5 min；DAB顯色5～20 min，充分沖洗；蘇木素復染2～3 min，充分水洗；鹽酸乙醇分化2 sec，充分水洗；脫水、透明：80%乙醇（5 min）→95%乙醇（5 min）→95%乙醇（5 min）→100%乙醇（5 min）→100%乙醇（5 min）→二甲苯（10 min）→二甲苯（10 min）；封片：中性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡），自然晾干。

1.3.5 皮膚和瘢痕成纖維細胞的分離、培養(yǎng)

切取的瘢痕及臨近正常皮膚組織，于1 h內在超凈工作臺內進行細胞原代培養(yǎng)，以4×104cells/cm2的密度接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，高糖培養(yǎng)液（GM：LG-DMEM，10%FBS，100 mg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素）、37℃、5%CO2、100%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，24 h后第1次換夜，以后隔日換液1次，待細胞長成單層后消化傳代。

1.3.6 Real-time PCR

從HS組織中提取RNA，并培養(yǎng)成纖維細胞，取體外培養(yǎng)的第1代成纖維細胞，提取RNA，進一步逆轉錄合成cDNA，用于定量PCR實驗。正常皮膚組織及其成纖維細胞為對照組作相同處理，行各項纖維化指標及microRNA-21的驗證。

1.3.7 轉染實驗

轉染前1 d，接種適當數(shù)量的細胞至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL含胎牛血清、不含抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液，使轉染時的細胞密度能夠達到30%～50%。繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

每個樣品按以下步驟準備mimic-lip2000混合液。①稀釋microRNA mimic：用50 μL不含抗生素和胎牛血清的Opti-MEM，稀釋1.25 μL（20 μmol）的microRNA mimic儲存液，并輕輕混勻，室溫孵育5 min；②稀釋脂質體lip2000：用50 μL不含抗生素和胎牛血清的Opti-MEM稀釋1 μL lip2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min；③將稀釋microRNA mimic與稀釋脂質體lip2000輕輕混勻，室溫孵育20 min。

將microRNA mimic-lip2000混合液加入含有細胞的400 μL培養(yǎng)基中，輕輕搖晃混勻。4～6 h后，將孔中含microRNA mimic-lip2000混合液的培養(yǎng)液棄去，更換2 mL新鮮培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取樣。

1.3.8 TGF-β誘導實驗

選取適當數(shù)量的第1代成纖維細胞接種于六孔板中，24 h后換TGF-β誘導液（低糖無血清生長培養(yǎng)液，10 ng/mL TGF-β）進行培養(yǎng)，中間不換液。誘導48 h后，傾去培養(yǎng)液，以PBS清洗2遍，細胞取樣，備用PCR實驗。未誘導組作為陰性對照。

1.3.9 Real-time PCR

對于以上不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細胞進行定量PCR檢測，觀測纖維化相關蛋白Col 1 A1、Col 3 A1及microRNA-21的表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有結果均采用x±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件（Student's t檢驗）進行統(tǒng)計學分析，當P＜0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織膠原定量檢測

在9對正常皮膚和瘢痕組織樣本中，每對樣品各選擇4個獨立的點進行檢測，以排除樣品自身變異性，最后取4個點的平均值繪圖。結果顯示，皮膚膠原蛋白的濃度范圍為15.7～25.6 μg/mg（干重），增生性瘢痕膠原蛋白的濃度范圍為48.9～78.5 μg/mg（干重）。增生性瘢痕組織中的膠原蛋白含量高于正常皮膚（圖1）。

圖1 各樣品組織中的膠原蛋白含量檢測Fig.1 Collagen content in each group(dry weight)

2.2 組織學觀察和細胞外基質免疫組化檢測

與正常皮膚組織相比，增生期瘢痕真皮層明顯增厚，真皮乳頭層、網(wǎng)狀層界限不清，膠原纖維致密，膠原束排列紊亂，淺層則呈結節(jié)或漩渦狀分布，其間細胞成分及微血管增多，細胞核分裂相多見。正常皮膚組可見大量的毛囊等皮膚附件，真皮乳頭層和網(wǎng)狀層界限較明顯，膠原纖維排列疏松，細胞成分及血管數(shù)目相對較少（圖2）。免疫組織化學染色顯示，細胞外基質在增生性瘢痕中的表達明顯高于正常皮膚（圖3）。

2.3 細胞外基質及microRNA-21的Real-time PCR檢測

Real-time PCR結果顯示，在增生性瘢痕組織及其成纖維細胞中，Col 1 A1、Col 3 A1、Fn和α-SMA的表達量明顯高于對照組，在增生性瘢痕組織及其成纖維細胞中microRNA-21的表達同樣明顯上調。重復實驗三次結果均有意義（圖4、5）。

2.4 TGF-β誘導及microRNA-21反義表達載體轉染

第1代HS成纖維細胞表現(xiàn)為相對均一的成纖維樣，呈梭形；當成纖維細胞在TGF-β誘導液中培養(yǎng)48 h后，細胞質顏色加深，逐漸聚集成團。定量PCR結果顯示，第1代成纖維細胞經TGF-β誘導后，細胞表達microRNA-21的量明顯增加（圖6）。此外，瘢痕組織成纖維細胞經TGF-β誘導48 h后，再行microRNA-21反義表達載體轉染7 h，然后換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)36 h，取樣，定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Col 1 A1和Col 3 A1的表達降低（圖7）。以上結果表明，細胞增殖加快，合成、分泌細胞外基質能力增強。

圖2 正常皮膚及增生性瘢痕的組織學觀察Fig.2 Histological observation in each group by HE staining and Masson's trichrome staining

圖3 免疫組化染色檢測Col 1 A1、Col 3 A1、Fn和α-SMA在正常皮膚和增生性瘢痕組織中的表達Fig.3 The expression of Col1A1,Col3A1,Fn and α-SMA in each group by immunohistochemistry

圖4 Col 1 A1、Col 3 A1、Fn及α-SMA mRNA在增生性瘢痕和正常皮膚組織（A-D）和細胞（E-H）中的表達（***：P＜0.001；**：P＜0.01）Fig.4 The expression of Col1A1,Col3A1,Fn and α-SMA mRNA in tissue(A-D)and fibroblasts(E-H)of each group(***:P＜0.001;**:P＜0.01)

圖5 microRNA-21 mRNA在增生性瘢痕和正常皮膚組織（A）和細胞（B）中的表達（***：P＜0.001）Fig.5 The expression of microRNA-21 mRNA in tissue(A)and fibroblasts(B)of each group(***:P＜0.001)

圖6 TGF-β誘導后microRNA-21的表達（***：P＜0.001）Fig.6 The expression of microRNA-21 after TGF-β induction(***:P＜0.001)

圖7 TGF-β誘導后microRNA-21反義表達載體轉染，成纖維細胞中Col 1 A1（左）、Col 3 A1（右）的表達（**：P＜0.01）Fig.7 The expression of Col 1 A1(L)and Col 3 A1 (R)after inhibitor-microRNA-21 transfection and TGF-β induction(**:P＜0.01)

3 討論

組織內膠原合成與降解的正常穩(wěn)態(tài)被打亂，導致以膠原蛋白為主的細胞外基質過度合成并沉積，從而形成增生性瘢痕。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織中的細胞外基質如Col 1 A1、Col 3 A1、Fn和α-SMA的表達水平明顯高于正常皮膚，符合以前的研究結果[16-17]。

microRNA被證明在不同的生理和病理過程中發(fā)揮著功能性作用，包括細胞內的信號轉導通路和器官的形態(tài)發(fā)生[18]。不同的microRNA的表達失調往往會造成不同的疾病。在這些變化的microRNA中，有許多microRNA被預測作為眾多基因的抑制劑參與自身免疫、血管硬化等疾病的過程中，只有很少一部分被證明參與了肝臟纖維化的疾病過程中[19-21]。最近一些報道顯示，microRNA參與纖維化疾病細胞外基質的代謝過程，并且microRNA的失調在瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展中有著重要的作用[22]。在博萊霉素誘導的肺纖維化中，一些microRNA的表達有顯著改變，以microRNA-21的增高表達最為明顯。在我們的實驗研究中也證實了增生性瘢痕組織中microRNA-21的表達量高于正常皮膚組織，這可能與肌成纖維細胞在增生性瘢痕中促進microRNA-21的表達，而microRNA-21也促進成纖維細胞的聚集有關[23]。

TGF-β是一種重要的細胞因子，調節(jié)細胞不同的生理過程，如細胞增殖、分化、凋亡、黏附、遷移。為了保持細胞或/或器官內穩(wěn)態(tài)平衡，TGF-β信號通路在不同水平有著精確的調控作用。TGF-β信號通路功能障礙或失調，與很多疾病相關，如纖維化疾病、炎性疾病和腫瘤的發(fā)生等[24]。異常的microRNA表達與很多病理生理過程的發(fā)生和發(fā)展密切相關，一些microRNA參與許多器官的纖維化過程，包括心臟、腎臟、肝臟和肺等[25]。因此，明確特定的microRNA在纖維化疾病發(fā)病機制中的作用（特別是在TGF-β信號通路中），有助于更清楚理解HS的發(fā)病機制，從中探索一些診斷、治療和預防HS的新方法。我們進一步用TGF-β誘導成纖維細胞，導致microRNA-21表達顯著增加，成纖維細胞合成并分泌Col 1 A1、Col 3 A1的水平在TGF-β誘導后也顯著增加。

雖然我們的研究結果表明microRNA-21在調控增生性瘢痕纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，但是尚不明確microRNA水平和靶蛋白mRNA表達之間直接的一對一調節(jié)關系。為了進一步確認microRNA的功能改變是否對靶基因mRNA的表達水平有直接調節(jié)作用，在成纖維細胞中進行microRNA-21的沉默表達實驗是有必要的。

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Effect and Mechanism of TGF-β Mediated Signal Pathway Modulated by microRNA-21 in Hypertrophic Scars

ZHANG Qi1,WANG Chen2.
1 Department of Orthopaedics,People's Hospital of Dancheng County,Zhoukou 477150,China; 2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai 9th People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:Chen Wang(E-mail:wangchen2369@163.com).

ObjectiveTo evaluate the effect and mechanism of microRNA-21 in hypertrophic scars(HS)formation and to provide novel target in biological control of HS.MethodsNormal skin tissue and HS tissue were harvested.Collagen quantitative detection and histological observation were carried out.The expression of collagen 1A1(Col1A1),collagen 3A1 (Col3A1),Fibronectin(FN)and α-SMA were detected by quantitative real-time PCR.The expression of microRNA-21 mRNA in normal skin tissue and HS tissue were also detected.Cells isolated from normal skin tissues and HS tissues were cultured,the microRNA-21 antisense RNA interference vector were constructed,while TGF-β was added at the same time. Furthermore,the effects of inhibitor-microRNA-21 and TGF-β on the biological characteristics of fibroblasts were observed. ResultsThe content of collagen in hypertrophic scar was higher than that in normal skin.The expression of extracellular matrix such as Col1A1,Col3A1,FN and α-SMA in scar tissue were significantly increased.The expression of microRNA-21 in HS tissue was higher than in normal tissue.TGF-β enhanced the expression of microRNA-21 in fibroblasts of HS tissues, while the inhibition of microRNA-21 decreased the expression of those scar-related genes.ConclusionThe skin after wound healing could increase the expression of microRNA-21 which promotes the synthesis of extracellular matrix,and TGF-β may further strengthen the role of microRNA-21 in the formation of HS.

Hypertrophic scar;Extracellular matrix;Transforming growth factor-β(TGF-β);microRNA

R619+.6

A

1673－0364（2014）06－0318－06

2014年8月30日；

2014年10月19日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.005

國家自然科學基金（81201204）；上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金（ZZjdyx12100）。

477150河南省周口市鄲城縣人民醫(yī)院骨科（張奇）；200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科（王琛）。

王?。‥-mail：wangchen2369@163.com）。