焦珍珍，方全 ，黃建鳳

氧化型低密度脂蛋白對正常人外周血單核細胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑受體蛋白表達的影響

焦珍珍，方全 ，黃建鳳

目的： 探討不同時間點不同濃度氧化型低密度脂蛋白（ oxLDL）對正常人外周血單核細胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（uPAR）蛋白的表達情況的影響。

方法： 選取正常人外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞（PBMC），用含20%自體血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，收取其帖壁的單核細胞，以免疫印跡雜交法（Western Blot）方法檢測不同濃度oxLDL對正常人單核細胞干預24h，72h的uPAR、LOX-1的蛋白表達。

結(jié)果： oxLDL干預正常人單核細胞24小時后，隨著其濃度的增加uPAR及LOX-1蛋白表達上調(diào)，在50 μg/ml時達峰，而高濃度組（100 μg/ml）對兩者的蛋白表達起著抑制作用。oxLDL刺激正常人單核細胞72小時后，低濃度（10 μg/ml）不能有效地增加uPAR的表達，較高濃度（50 μg/ml、100 μg/ml）能夠較有效地增加uPAR的表達。oxLDL刺激正常人單核細胞72小時后，LOX-1的表達隨著濃度的增加而上調(diào)，但濃度≥50 μg/m l時，其表達有所下降。

結(jié)論： 本研究中oxLDL不同作用時間對uPAR及LOX-1的影響不同，提示了oxLDL致炎癥過程的復雜性。

氧化低密度脂蛋白；尿激酶型纖溶酶原激活劑；凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:288.)

氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，它參與動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展是較為明確的[1]，主要通過兩種機制促進動脈粥樣硬化的發(fā)展：一是單核巨噬細胞通過清道夫受體攝入oxLDL，引起血管壁泡沫細胞的堆積和脂紋的形成；二是oxLDL改變了內(nèi)皮細胞的多種功能，如誘導內(nèi)皮表達黏附分子、血管平滑肌生長因子、集落刺激因子以及單核細胞化學趨化蛋白-1等，同時還通過降低一氧化氮（NO）的產(chǎn)生而減弱內(nèi)皮依賴性舒張反應。尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（uPAR）最早被Vassalli和Stoppelli等在人類外周血的單核細胞中發(fā)現(xiàn)。它廣泛存在于多種細胞表面，如外周血白細胞、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞、成纖維細胞及骨髓細胞等，此外還可表達于多種腫瘤細胞表面。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）是一種在內(nèi)皮細胞豐富表達的Ⅱ型單鏈跨膜蛋白，屬C型選擇素家族，在單核細胞，巨噬細胞，血小板，平滑肌細胞也有表達。oxLDL可通過與內(nèi)皮細胞表面的LOX-1結(jié)合激活內(nèi)皮，影響內(nèi)皮功能，損傷血管，參與動脈粥樣硬化的進展。LOX-1具有對oxLDL的特異性結(jié)合、內(nèi)吞以及降解作用，但是對天然的及乙酰化的低密度脂蛋白（LDL）無此作用。LOX-1與oxLDL之間的特異性結(jié)合可以被多聚肌苷酸和角叉菜膠抑制[2]?；罨膯魏思毎趧用}粥樣硬化的病理機制中發(fā)揮著重要的作用[3]。單核細胞需粘附到血管壁、遷移至炎癥灶的局部，才能發(fā)揮致炎癥的潛力。在這一復雜過程中，需要粘附分子的受體及其復合受體參與，如uPAR和LOX-1[4]。在oxLDL活化單核細胞的過程中，uPAR與LOX-1表達均會有改變。本研究旨在探討oxLDL對正常人外周血單核細胞中uPAR及LOX-1的蛋白水平的影響。

1 對象和方法

研究對象的收集：正常人來自2010-11到2011-03招募的健康志愿者，條件符合以下標準：①年齡≥18歲；②無2型糖尿病及動脈粥樣硬化性疾??；③肝腎功能正常；④無腫瘤等惡性疾病史；⑤血脂代謝正常；⑥無感染性疾病風濕免疫性疾病等。上述健康志愿者簽署知情同意書?？崭?2小時以上，嚴格無菌條件下抽取外周血200 m l，分別置于9 m l依地酸二鈉（EDTA）抗凝管中充分混勻，取血6小時內(nèi)在無菌條件下進行以下操作。

人外周血單個核細胞的分離及培養(yǎng)：①全血靜置后以1500 r/min離心10 min，去血漿；②以3倍D-Hank’s稀釋血細胞形成混合液；③將混合液緩慢疊加于淋巴細胞分離液之上（兩者體積比2：1）；④2000 r/min 離心30 min,可見4層，從上至下取第二層（白色云霧狀），純化、計數(shù)；⑤接種于6孔板以RPMI1640+20%自體血清+雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑥6小時后以不同濃度oxLDL干預，分別于24h、72h收取貼壁的單核細胞提取蛋白質(zhì)。

免疫印跡雜交法（Western blot）：①RIPA裂解液制備細胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（Biomed）測定蛋白含量；②聚丙烯酰氨凝膠制備，上樣與電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，結(jié)合一抗，洗滌，結(jié)合二抗，電化學發(fā)光（ECL）顯影，半定量分析。

統(tǒng)計學處理：運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩濃度之間比較采用t檢驗，P＜0.05則有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)oxLDL干預24小時（圖1、2），隨著oxLDL濃度的增加，uPAR及LOX-1的蛋白表達呈上升趨勢；當oxLDL為10 μg/m l、20 μg/m l、50 μg/m l刺激外周血單核細胞后uPAR及LOX-1蛋白表達水平較0 μg/m l顯著升高（P＜0.05），且3個濃度之間的表達差異有統(tǒng)計學意義；50 μg/m l的oxLDL對uPAR及對LOX-1表達刺激最為明顯，相對于其他濃度組亦有明顯的促進作用（P＜0.05）；oxLDL 濃度為 100 μg/m l時，對 uPAR和對LOX-1蛋白表達呈抑制趨勢，與0 μg/m l和50 μg/m l比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；多聚肌苷酸（polyi）對LOX-1蛋白表達有著較明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），多聚肌苷酸對uPAR的表達則未見抑制作用。

經(jīng)oxLDL干預72小時（圖3、4），當oxLDL為10 μg/m l 時不能有效增加 uPAR 的表達，50 μg/ml、100 μg/m l刺激外周血單核細胞后uPAR蛋白表達水平較oxLDL 0 μg/ml顯著升高 （P＜0.05），10 μg/ml、20 μg/m l、50 μg/m l、100 μg/ml濃度之間的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；100 μg/m l的oxLDL對uPAR表達刺激最為明顯，相對于其他濃度組亦有明顯的促進作用（P＜0.05）； oxLDL 濃度為 10 μg/m l、20 μg/m l時，對LOX-1蛋白表達呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；50 μg/m l 表達有所下降，但與oxLDL 0 μg/m l 比較差異仍有統(tǒng)計學意義。polyi對uPAR和LOX-1蛋白表達均有著較明顯的抑制作用（P＜0.05）。

圖1 24小時uPAR蛋白表達情況

圖2 24小時LOX-1受體表達

圖3 72小時uPAR蛋白表達情況

圖4 72小時LOX-1受體表達

3 討論

動脈粥樣硬化是發(fā)達國家人口的主要死亡原因[5]，也是心血管疾病共同的病理基礎。1999年初，Ross等[6]提出動脈粥樣硬化是發(fā)生在大血管及中血管的一種慢性炎癥。炎癥是動脈粥樣硬化病變的基礎病理變化，目前已有許多的炎性因子被研究證實參與了冠心病的發(fā)生和發(fā)展，uPAR和LOX-1亦是其中之一[7-9]。本研究應用正常人外周血單核細胞作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核細胞經(jīng)過不同濃度的oxLDL干預以后，uPAR及LOX-1的蛋白表達有所區(qū)別。由圖1可看出：不同濃度的oxLDL干預正常人外周血單核細胞24小時后，uPAR的表達隨著濃度的升高表達上調(diào)，在50 μg/m l時達到峰值，100 μg/ml較前一組表達反而下降，polyi與 50 μg/m l相比，uPAR表達上調(diào)。由圖2可看出：不同濃度的oxLDL干預正常人外周血單核細胞24小時后，LOX-1的表達隨著濃度的升高而上調(diào)，在50 μg/m l時達到峰值，100 μg/m l較前一組表達反而下降，polyi與50 μg/ml相比，LOX-1表達下調(diào)。由圖3可看出：不同濃度的oxLDL干預正常人外周血單核細胞72小時后，10 μg/m l濃度組較 0 μg/m l表達下調(diào)，20 μg/ml與0 μg/m l表達基本一致，之后表達開始上調(diào)，在100 μg/m l達峰。Polyi較 50 μg/m l表達下調(diào)。由圖 4可看出：不同濃度的oxLDL干預正常人外周血單核細胞 72 小時后，10 μg/m l、20 μg/ml較 0 μg/m l表達上調(diào)，20 μg/ml時達峰，50 μg/m l時較 20 μg/ml下調(diào)，在 100 μg/m l時與 0 μg/m l基本相似。Polyi組較 50 μg/m l表達下調(diào)。

采用Western blot方法的研究結(jié)果顯示50 μg/ml的oxLDL對uPAR及LOX-1的蛋白表達刺激最為明顯，相對于其他濃度組亦有明顯的促進作用（P＜0.05），提示oxLDL可能影響uPAR及LOX-1的表達參與炎癥反應、進而參與動脈粥樣硬化進展。研究發(fā)現(xiàn)[10]：不同濃度的oxLDL干預人冠狀動脈內(nèi)皮細胞過程中，LOX-1的表達呈現(xiàn)濃度依賴性，在40 μg/m l表達最高，100 μg/m l呈現(xiàn)抑制。國內(nèi)[11,12]也有研究顯示，在巨噬細胞中，oxLDL干預下LOX-1表達的達峰濃度為75 μg/m l，隨后表達下降。本研究中，LOX-1表達的峰值濃度為50 μg/m l，與國內(nèi)外既往的研究結(jié)果相近。oxLDL以濃度依賴性的方式刺激LOX-1的表達上調(diào)，而且oxLDL與LOX-1結(jié)合后可使巨噬細胞吞噬oxLDL的能力進一步加強，說明在oxLDL介導的機體損傷中，uPAR和LOX-1一樣，在早期即顯示出生物學作用，但具體表現(xiàn)為防御性保護作用還是損傷作用，尚無法定論。oxLDL濃度為100 μg/m l時，對uPAR和LOX-1蛋白表達呈抑制趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），oxLDL高濃度時對uPAR及LOX-1的抑制作用，其生物機制有待后續(xù)研究；Polyi作為LOX-1的抑制劑，特異性地抑制LOX-1 表達[13]。

對于uPAR的表達，在72小時與24小時相比而言，10 μg/m l組表達較 0 μg/m l下調(diào)，并且oxLDL對于uPAR表達的刺激作用的濃度峰值后移，可能顯示了低濃度的oxLDL時可能機體呈現(xiàn)出短期防御性細胞免疫保護的過程，而大于20 μg/m l才是真正損傷的濃度范圍。兩個時間點比較而言，峰值后移說明長時程（72小時）方可顯現(xiàn)真正的損傷的因素。

本研究仍存在一定的局限性。比如，所購買的oxLDL為人工合成，與人體內(nèi)的表達產(chǎn)物功能上還是有一定差異。在原代單核細胞進行培養(yǎng)的過程中，雖然盡量模擬體內(nèi)生理狀態(tài)，予以刺激仍可能會導致細胞表型的部分改變及某些基因和蛋白的激活。本研究未顯示時間依賴性的刺激表達結(jié)果及相關(guān)功能實驗結(jié)果，需要今后進一步的研究證實。

綜上所述，oxLDL干預正常人外周血單核細胞24小時后，隨著其濃度的增加uPAR及LOX-1蛋白表達上調(diào)，在50μg/m l時達峰，而高濃度組（100 μg/ml）對兩者的蛋白表達起著抑制作用。oxLDL刺激正常人單核細胞72小時后，低濃度（10 μg/ml、20 μg/m l）不能有效地增加uPAR的表達，較高濃度（50 μg/m l、100 μg/m l）能夠較有效地增加 uPAR 的表達；而LOX-1的表達隨著oxLDL濃度的增加先上調(diào)后又下降。該結(jié)果提示oxLDL不同作用時間對uPAR及LOX-1的影響不同，提示了oxLDL致炎癥過程的復雜性。oxLDL參與動脈粥樣硬化進程的生物機制還需今后近一步研究。

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（編輯：汪碧蓉）

Effect of Oxidative LDL on Protein Expressions of Lectin Like Oxidized LDL Receptor-1 and Urokinase Type Plasm inogen Activator Receptor in Normal Human Peripheral Blood M ononuclear Cells

JIAO Zhen-zhen, FANG Quan, HUANG Jian-feng.
Department of Functional Testing, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HUANG Jian-feng, Email: jianfhuang@sina.com

Objective: To investigate the effect of oxidative LDL (oxLDL) on protein expressions of lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) and urokinase type plasm inogen activator receptor (uPAR) in normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Methods: The normal human PBMC was isolated by Ficoll-paque density gradient centrifugation and cultured w ith RPM I 1640 medium w ith 20% antologous serum. Western blot was conducted to detect the effect of oxLDL at different concentrations and time periods on protein expressions of LOX-1 and uPAR in normal human PBMC.

Results: For 24-hour oxLDL treatment, the protein expressions of uPAR and LOX-1 were increased w ith the elevated oxLDL concentrations, oxLDL 50 μg/m l was the peak, while the expressions were inhibited by oxLDL 100 μg/m l. With 72-hour oxLDL treatment, the low concentration of oxLDL 10 μg/m l could not increase uPAR protein expression, while oxLDL 50 μg/m l and 100 μg/m l could effectively increase uPAR protein expression; the LOX-1 expression was increased according to the elevated oxLDL concentrations, while the expression decreased at oxLDL ≥50 μg/m l.

Conclusion: Our work indicated that different concentrations and time periods of oxLDL treatment may affect the protein expressions of uPAR and LOX-1 at different degrees which suggested that oxLDL-induced inflammatory process was complicated.

Oxidative LDL; Lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1; Urokinase type plasm inogen activator receptor

100037 北京市，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 心血管病研究所 阜外心血管病醫(yī)院 功能檢測中心（焦珍珍、黃建鳳），中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 心內(nèi)科（方全）

焦珍珍 住院醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病的發(fā)病機制的相關(guān)研究 Email：jiaozz789@126.com 通訊作者：黃建鳳 Email：jianfhuang@sina.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 04-0288-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.04.013

2013-09-25）

病例報告