張小娟，任滿意，曹曉青，張春盛，劉同寶

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

趨化因子受體6基因敲除對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響

張小娟，任滿意，曹曉青，張春盛，劉同寶

目的：探討趨化因子受體6（CCR6）基因敲除對(duì)ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其作用機(jī)制。

方法：雜交培育CCR6基因敲除（CCR6-/-）ApoE-/-小鼠20只作為實(shí)驗(yàn)組，普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠20只作為對(duì)照組，給予高脂飲食。12周后將小鼠處死進(jìn)行取材固定，主動(dòng)脈根部冰凍切片進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色、油紅O染色及巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的免疫組化染色，對(duì)斑塊的形態(tài)、面積及組成進(jìn)行觀測(cè)。并培育巨噬細(xì)胞，進(jìn)行了噻唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，對(duì)機(jī)制進(jìn)一步分析。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比斑塊面積顯著減小[（8.3±1.9）% vs （16.1±2.0）%， P＜0.05]；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積 [（14.4±2.1）% vs （28.5±3.4）%] 及主動(dòng)脈大體脂質(zhì)沉積[（4.9±2.8）% vs （13.6±3.2）%] 均提示實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)沉積顯著減小（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞[（18.9±2.8）% vs （35.7±4.5）%] 及MCP-1表達(dá)減少[(16.3±2.2) % vs （23.1±5.6）%]。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：CCR6通過(guò)影響脂質(zhì)沉積、巨噬細(xì)胞增殖遷移促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

動(dòng)脈粥樣硬化；趨化因子受體6；巨噬細(xì)胞；單核細(xì)胞趨化蛋白1

Methods: Our research included 2 groups, Experimental group, n=20 CCR6-/-ApoE-/-mice and Control group, n=20 CCR6+/+ApoE-/-mice. Both groups received high-fat diet for 12 weeks, and then, the aortic roots were collected for HE staining, the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in macrophages for immune-histochemisty staining, the macrophages were cultured for migration study, and the results were compared between 2 groups.

Results: The plaque areas in Experimental group was signif i cantly smaller than those in Control group, (8.3±1.9) % vs (16.1±2.0) %, P<0.05. The Experimental group had less lipid deposition in aortic root, (14.4±2.1) % vs (28.5±3.4) %, and less lipid deposition in aorta (4.9±2.8) % vs (13.6±3.2) %, all P<0.05. The Experimental group showed less macrophages and lower MCP-1 expression in plaques, (18.9±2.8) % vs (35.7±4.5) % and (16.3±2.2) % vs (23.1±5.6) %, all P<0.05.

Conclusion: CCR6 promotes atherogenesis plaque formation by lipid deposition and macrophage migration in ApoE-/-mice.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:300.)

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以脂質(zhì)斑塊在動(dòng)脈壁聚積為特征的疾病，伴有動(dòng)脈管壁增厚變硬、血管彈性減退及管腔縮窄。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化是一種巨噬細(xì)胞介導(dǎo)

的，多種炎癥因子參與的炎癥性疾病[1]。血液中脂質(zhì)在管壁的過(guò)度沉積造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，單核細(xì)胞浸潤(rùn)，當(dāng)單核細(xì)胞從損傷的內(nèi)皮細(xì)胞之間移行至內(nèi)膜下后，在各種炎癥介質(zhì)的刺激下活化為巨噬細(xì)胞，又是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟[2]。

巨噬細(xì)胞遷移的過(guò)程以及導(dǎo)致其遷移的趨化因子及其受體已經(jīng)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。趨化因子通過(guò)特異性地偶聯(lián)其在靶細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體而調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移。在眾多的趨化因子和受體中，趨化因子受體6 （chemokine receptor 6, CCR6）及其配體CC趨化因子配體20（C-C chemokine ligand 20，CCL20）被認(rèn)為具備穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的功能，新近發(fā)現(xiàn)它們同樣能在炎癥中發(fā)揮作用[3]。本研究利用CCR6基因敲除（CCR6-/-）及載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠分析CCR6在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物來(lái)源、飼養(yǎng)及分組

動(dòng)物模型的建立：于2012-03至2013-06，將清潔級(jí)6周齡雌性ApoE-/-小鼠（維通利華，北京，中國(guó)）和CCR6-/-小鼠（Jackson Labs，Bar Harbor, Maine 04609 USA）進(jìn)行雜交培養(yǎng)，飼養(yǎng)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

分 組：20只 8周 齡 的 雜 交 培 育 CCR6-/-ApoE-/-小鼠納入實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為20只普通CCR6+/+ApoE-/-小鼠。兩組小鼠均給予高脂飼料（含膽固醇0.15%，脂肪21%）喂養(yǎng)12周后，將小鼠處死并行血清血脂及主動(dòng)脈病理學(xué)檢查。

1.2檢測(cè)指標(biāo)

蘇木素伊紅（HE）染色：取冰凍切片常規(guī)做HE染色，從每只小鼠主動(dòng)脈根部連續(xù)切片，每間隔5張取l張，共取3張切片。在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊大小，用多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件（ImagePro-Plus soft-ware）分別測(cè)出斑塊面積及血管內(nèi)、外膜長(zhǎng)度，回歸標(biāo)準(zhǔn)圓形后計(jì)算斑塊面積與血管管腔面積之比。

油紅O染色：制備冰凍切片，常規(guī)行油紅O染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量的多少。完整取下小鼠主動(dòng)脈，剝離主動(dòng)脈外膜，拋開(kāi)主動(dòng)脈行油紅O染色，ImagePro-Plus soft-ware計(jì)算脂質(zhì)與血管面積之比。

免疫組化染色：冰凍切片晾干30 min，入蒸餾水中水化30 min，再入0.3%過(guò)氧化氫（H2O2）溶液內(nèi)室溫100 min。然后血清封閉1 h，以減少非特異性反應(yīng)。抗單核—巨噬細(xì)胞標(biāo)志物抗體（Monocyte/ Macrophage Marker，MOMA-2，1：200）檢測(cè)組織切片中巨噬細(xì)胞表達(dá)[4]，抗單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）抗體（1：100）檢測(cè)組織切片中MCP-1表達(dá)。在光學(xué)顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，采用ImagePro-Plus soft-ware做圖像數(shù)字采集及半定量分析。

1.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection （ATCC,美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心）,用含有10%胎牛血清（杭州四季青公司）的RPMI1640（GIBCO，Life Technologies，上海，中國(guó)）培養(yǎng)基在37℃、5%的二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d細(xì)胞長(zhǎng)滿，即可傳代培養(yǎng)。

蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）：細(xì)胞經(jīng)過(guò)裂解后，4℃，12 000 g離心10 min，二辛可寧酸法蛋白檢測(cè)（bicinchoninic acid protein assay, BCA）法定量檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度[5]。加入蛋白上樣緩沖液，煮沸使蛋白質(zhì)變性。相同蛋白含量的提取液加入積層膠90 V，分離膠120 V，電泳分離細(xì)胞蛋白，200 mA將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗（兔抗小鼠MCP-1濃度1：1000），4℃孵育6～12 h。TBST（Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.5%, pH=7.6）洗膜3次，每次5～10 min。加入二抗（山羊抗兔二抗1：20 000），室溫孵育2 h，Tris鹽水吐溫緩沖液（TBST）洗膜3次。最后加入顯影液，印記曝光于X光片上后，進(jìn)行圖像分析。

噻唑藍(lán)比色（MTT）實(shí)驗(yàn)：將RAW264.7細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的濃度將經(jīng)小分子干涉RNA（siRNA）干擾的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別加入96孔板，每孔200 μl。12 h后每孔均加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，選擇490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔吸光度，并繪制生長(zhǎng)曲線。

細(xì)胞遷移（Transwell）實(shí)驗(yàn)：24孔板內(nèi)每孔加有600 μl的培養(yǎng)基（含10%血清），后在細(xì)胞遷移的內(nèi)室分別加入經(jīng)或未經(jīng)siRNA處理的RAW264.7細(xì)胞（100 μl，含0.1%血清），放入培養(yǎng)箱，12 h后，取出細(xì)胞遷移，用棉簽擦去聚碳酸膜（PVPF膜）靠近內(nèi)室那一面的細(xì)胞，另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，記數(shù)。

CCR6 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)：CCR6 siRNA試劑盒購(gòu)

自 Selleck （Houston, TX 77054 USA），500 μl Opti-MEM（GIBCO）稀釋siRNA （轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為33 nM），500 μl Opti-MEM稀釋1.0 μl LipofectamineTM2000 （Invitrogen, Life Technologies，上海），輕輕吹吸3 次混勻，室溫下靜置5 min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和siRNA 稀釋液，室溫下靜置20 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞板中，1 ml/孔轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)基。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。測(cè)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊形成

HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組可見(jiàn)小鼠主動(dòng)脈根部形成大面積斑塊，占管腔面積為[(16.1±2.0)%]，實(shí)驗(yàn)組亦可見(jiàn)斑塊形成，但斑塊面積[(8.3±1.9)%]顯著少于對(duì)照組（圖1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積

油紅O染色發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組可見(jiàn)小鼠主動(dòng)脈根部形成大面積斑塊，內(nèi)含大量紅染脂質(zhì)，占斑塊面積的（28.5±3.4）%；實(shí)驗(yàn)組亦可見(jiàn)斑塊形成，但斑塊內(nèi)紅染脂質(zhì)（14.4±2.1）%顯著少于對(duì)照組（圖2A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。主動(dòng)脈大體仍然可以發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組斑塊中的紅染面積[（13.6±3.2）%]顯著大于實(shí)驗(yàn)組[（4.9±2.8）%]（圖2B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3趨化因子受體6基因敲除抑制斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集

單核—巨噬細(xì)胞表面特異性標(biāo)志抗原抗體染色結(jié)果：對(duì)照組可見(jiàn)小鼠主動(dòng)脈根部單核—巨噬細(xì)胞[（35.7±4.5）%]表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈根部單核—巨噬細(xì)胞[（18.9±2.8）%]顯著減少（圖3）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4趨化因子受體6 siRNA 抑制巨噬細(xì)胞增殖遷移

噻唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCR6 siRNA干預(yù)6 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比[（129.4±12.2）vs （113.8±9.4）] 和 CCR6 siRNA干 預(yù) 12 h [（147.2±13.5） vs（126.7±15.3）] ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCR6 siRNA干預(yù)24 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞的遷移（183.4±19.3 vs 122.8±8.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 兩組小鼠（n=20）主動(dòng)脈根部蘇木素伊紅染色結(jié)果

圖2 兩組小鼠（n=20）油紅O染色結(jié)果

圖3 兩組小鼠（n=20）主動(dòng)脈根部單核—巨噬細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果

2.5趨化因子受體6基因敲除抑制單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)

MCP-1免疫組化研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠主動(dòng)脈根部MCP-1[（16.3±2.2）%]表達(dá)顯著低于對(duì)照組[（23.1±5.6）%]（圖4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 趨化因子受體6促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)

3 討論

趨化因子(chemokines)是由小分子分泌蛋白組成的一個(gè)大的細(xì)胞因子超家族, 能趨化細(xì)胞作定向移動(dòng)，在各種生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。趨化因子受體是異三聚體G蛋白耦聯(lián)受體,有7個(gè)跨膜區(qū)。根據(jù)受體結(jié)合的趨化因子種類的不同將受體分為4類:CR、CCR(CCR12CCR9) 、CXCR(CXCR12CXCR5)及CX3CR。

CCR6是巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α（MIP-3α/ CCL20）的受體,CCR6表達(dá)于多種白細(xì)胞亞型，包括樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、TH17細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[4,5]。Ruth等[6]的研究表明，CCL20-CCR6在體外實(shí)驗(yàn)中能導(dǎo)致單核細(xì)胞的趨化；而Le Borgne等[7]的研究進(jìn)一步表明，CCL20-CCR6能夠在體內(nèi)導(dǎo)致皮炎小鼠單核細(xì)胞的聚集。經(jīng)靜脈注射CCL20同樣引起單核巨噬細(xì)胞的聚集。對(duì)于靜止的單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞來(lái)說(shuō)，CCR6的表達(dá)是低水平的，但是在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞因子的刺激下CCR6的表達(dá)水平會(huì)迅速升高。最近研究甚至表明，CCR6在具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型兩種巨噬細(xì)胞上表達(dá)水平相當(dāng)。與健康動(dòng)脈相比，無(wú)論是人的還是小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化的冠狀動(dòng)脈和頸動(dòng)脈中，CCR6和CCL20的表達(dá)均明顯升高[8,9]。

本研究中，我們利用CCR6-/-敲基因小鼠第一次證明CCR6直接參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究完成CCR6-/-ApoE-/-雙敲小鼠模型的構(gòu)建，利用HE染色證明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠斑塊面積明顯減少，這說(shuō)明CCR6的存在能夠促進(jìn)斑塊的增長(zhǎng)。對(duì)主動(dòng)脈根部及主動(dòng)脈大體進(jìn)行油紅O染色，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，表明CCR6的存在直接或間接參與了脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。

為了進(jìn)一步研究CCR6影響斑塊形成及發(fā)展的機(jī)制，我們對(duì)斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行了免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量明顯減少，這證明了CCR6在斑塊內(nèi)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移。為了進(jìn)一步明確CCR6對(duì)巨噬細(xì)胞增殖遷移的促進(jìn)作用，我們?cè)隗w外應(yīng)用CCR6的siRNA阻斷CCR6的表達(dá)，結(jié)果表明阻斷CCR6后巨噬細(xì)胞增殖遷移活性均受到顯著影響。最后我們?cè)隗w內(nèi)和體外檢測(cè)了MCP-1的表達(dá)，結(jié)果顯示阻斷CCR6后MCP-1表達(dá)顯著減少，在體內(nèi)體外均證明了這一結(jié)論。有研究表明，CCR6與其配體CCL20的結(jié)合能夠干擾血糖代謝并促進(jìn)糖尿病的發(fā)病，而CCR6阻斷后能夠明顯抑制糖尿病的進(jìn)展。此外作為趨化因子，CCR6參與多種細(xì)胞因子的代謝，所以其與內(nèi)分泌存在關(guān)系，在以后的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步在這一領(lǐng)域做出研究。

動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[10,11]，上述所有結(jié)果共同表明，CCR6在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了舉足輕重的作用。這一發(fā)現(xiàn)將為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的防治提供新的依據(jù)。

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Effect of Chemokine Receptor 6 Knock-out on Atherosclerosis Plaque Formation in ApoE-/-Mice

ZHANG Xiao-juan, REN Man-yi, CAO Xiao-qing, ZHANG Chu-sheng, LIU Tong-bao.
Department of Cardiology, Shandong Provincial Chest Hospital, Jinan (250014), Shandong, China

Objective: To explore the effect of chemokine receptor 6 (CCR6) on atherosclerosis plaque formation in ApoE-/-mice.

Atherosclerosis; Chemokine receptor 6; Macrophage; Monocyte chemoattractant protein-1

2013-11-20)

（編輯：漆利萍）

250014 山東省濟(jì)南市，山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東省胸科醫(yī)院 心內(nèi)科

張小娟 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病臨床研究 Email: zxj13791050365@163.com 通訊作者：劉同寶 Email: liutongbao@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）04-0300-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.016