郭松佳，單樹花，晉小婷，李宗偉，宋 莉，李卓玉,*

（1.化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系，山西 汾陽 032200；3.太原師范學院生物系，山西 太原 030031）

腫瘤是嚴重危害人類健康的惡性疾病，抗腫瘤藥物的效果及安全性一直受到人們的廣泛關注，從天然產物中尋找活性成分已成為當今抗腫瘤藥物的發(fā)展戰(zhàn)略之一[1]。如白藜蘆醇對激素依賴性腫瘤有明顯的預防及治療作用，并已經進入臨床試驗階段[2-3]；黃酮類化合物可以誘導腫瘤細胞的凋亡，并具有干預細胞信號轉導和增強抑癌基因活性等功效[4-5]。由此可見，天然產物活性成分的開發(fā)對于腫瘤的預防及治療意義重大。

地皮菜，學名普通念珠藻（Nostoc commune Vauch.），為藍藻科念珠藻屬的片狀藻類，在全球范圍內均可生長[6]。地皮菜是一種營養(yǎng)極高的保健野菜[7]，其中很多營養(yǎng)成分都參與了人體的正常新陳代謝和生理機能。Briones等[8]研究表明，地皮菜中蛋白質的含量可以達到干質量的22.8%～28.7%。此外，它還含有特殊的活性成分，如藍藻蛋白、多糖等[9-11]。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)地皮菜中的活性蛋白可以有效抑制結腸癌細胞的增殖，經分離純化及質譜鑒定其為水應激蛋白。在組織缺水的情況下[12-14]，普通念珠藻類合成水應激蛋白，具有抵御干旱、維持組織結構穩(wěn)定的功能[15-16]。關于該蛋白的其他功能，尤其是抗腫瘤的功能，目前國內外尚未有報道。

根據(jù)已獲得的前期數(shù)據(jù)，利用基因工程重組技術，從地皮菜中得到一種新型水應激蛋白（recombinant water stress protein 1，Re-WSP1），并將該蛋白的基因序列公布于GenBank, 其序列號為KF 003026。將該基因克隆到原核表達系統(tǒng)中，獲得了高效表達工程菌，經親和純化獲得Re-WSP1。體外實驗結果顯示，該蛋白對結腸癌細胞SW480的生長具有明顯的抑制作用，與從天然產物中獲得的水應激蛋白具有同樣功能。因此，新型水應激蛋白的研究可以為抗癌功能食品或藥物中間體的開發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與細胞株

E.coli DH5α、E.coli BL21、質粒pET28a、人結腸癌細胞系SW480，人結腸正常上皮細胞FHC均為本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

RNA提取試劑Trizol、DNA Marker 大連寶生物公司；噻唑藍（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；質粒抽提試劑盒 Omega公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑 普利萊公司；蛋白Marker Ferment公司；核酸工具酶 日本TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、Ni-NTA resin 生工生物工程（上海）股份有限公司；Caspase 3、Caspase 8多克隆抗體 Bioworld Technology公司；BSA蛋白濃度測定試劑盒及蛋白裂解液 碧云天生物技術研究所；膠片 柯達公司；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基美國Hyclone公司；胎牛血清 武漢博士德公司；其他無機鹽均為進口或國內分析純。

Infinite F50酶標儀 瑞士Tecan公司；Gene genius凝膠成像分析系統(tǒng) 英國Syngene公司；Mastercycler personnal PCR擴增儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 地皮菜中cDNA的提取

將地皮菜組織在液氮中磨成粉末，加入Trizol液研磨。每毫升Trizol液加入0.2 mL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s。取上清液于一新離心管，每毫升上清液加0.5 mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，12 000×g離心10 min。棄去上清液，按每毫升Trizol液加入至少1 mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃條件下7 500×g離心5 min。小心棄去上清液，室溫或真空干燥10 min，然后將RNA 用DEPC水溶解沉淀后，于－80℃保存。吸取1 mL ddH2O到EP管中，加入2 μL地皮菜總RNA溶液，充分混勻，在Thermo Nanodrop 2000上測定260、280 nm波長處的吸光度，然后計算RNA的質量濃度，并分析其純度。在DEPC處理過的EP管中加入約4 μg總RNA和1 μL的Oligo（dT）18primer（0.5 μg/μL），小心混勻，70℃條件下保溫5 min，立即浸入冰水中。按次序分別加入下列試劑：5 μL 5×M-MLV RT Buffer、2 μL dNTP mix（2.5 mmol/L）、1 μL RNase抑制劑 （30 U/μL），1 μL M-MLV Reverse Transcriptase，然后加DEPC水到25 μL。小心混勻，室溫離心5 s，將所有溶液收集到管底，37℃條件下保溫1 h；90℃條件下處理5 min，冰上冷卻，用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

1.3.2 地皮菜水應激蛋白表達質粒的構建

利用P C R技術，并在W S P的N端添加6個組氨酸的His標簽設計引物，上游引物引入BamHⅠ限制性酶切位點，下游引物引入XhoⅠ限制性酶切位點，引物設計如下，上游引物：5’-CGCGGATCC ATGGCTCTTTACGGCT-3’（BamHⅠ），下游引物：5’-CCGCTCGAG TTATTCATTAACAATCGT- 3’（XhoⅠ），引物由TaKaRa公司合成。以地皮菜cDNA為模板，擴增WSP基因片段，PCR反應條件如下：95℃預變性3 min，95℃變性1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA序列測定，并和表達載體pET28a分別經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切后回收的WSP DNA和pET28a按物質的量比3∶1的比例混合，用T4 DNA Ligase 37℃連接2 h，轉化到DH5α感受態(tài)細菌中，鋪在含有卡那霉素的瓊脂平板上倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，挑取顆粒飽滿的單克隆菌落至5 mL LB培養(yǎng)基，37℃條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后進行菌液PCR和酶切鑒定。

1.3.3 WSP的基因序列測定及其表達

擴增、提取轉化子質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。PCR產物及轉化子質粒測序結果顯示100%相同，通過序列同源性比對和蛋白保守序列分析，鑒定為一種新的水應激蛋白基因序列，該蛋白的基因序列已經發(fā)表于GenBank，序列號為：KF003026。將測序鑒定后的WSP-pET28a表達載體轉化至BL21感受態(tài)細菌中，挑取單克隆菌落接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的原核表達菌按照體積比1∶100的接種到含有卡那霉素的400 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，在600 nm波長處測定溶液的吸光度A600nm至0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，同時設不添加IPTG的對照組，誘導表達4 h，于4℃、8 000 r/min離心15 min收集細菌。將細菌溶于裂解緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，pH 7.4）中，超聲破菌，離心收集上清，樣品分別加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃條件下煮5 min，12% SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，電泳結束后考馬斯亮藍染色20 min，洗脫液（含40%甲醇和10%冰乙酸），脫色后觀察分析。

1.3.4 Re-WSP1的純化和脫鹽濃縮

采用親和層析的方法純化目的蛋白，將5 mL預裝填料Ni-NTA親和材料加到空柱子中，待其沉降后加入冰預冷的結合緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 7.4）15 mL平衡柱子。將50 mL菌體破碎、離心后的上清用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液加到層析柱中進行親和純化。用15 mL冰預冷的結合緩沖液洗脫非特異性結合的雜蛋白，再用冰預冷的15 mL含300 mmol/L咪唑的洗脫溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）過夜透析（透析用的透析袋的規(guī)格為MD34，截留分子質量為3 kD），加入l0 kD超濾管中，4℃、3 800 r/min離心30 min，最終獲得脫鹽并濃縮的蛋白溶液，保存于－80℃。以SDS-PAGE電泳檢測上述步驟收集的樣品中是否含有目的蛋白，同時以未誘導的菌懸液作為對照。

1.3.5 MTT法檢測Re-WSP1對結腸癌細胞SW480生長的影響

采用MTT法，將處于對數(shù)生長期的人結腸癌SW480細胞、人正常結腸上皮FHC細胞，以8×103個/孔傳入96 孔培養(yǎng)板，37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入質量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 μg/μL的Re-WSP1，每組設5個復孔，并用PBS緩沖液作為對照。孵育48 h后吸棄孔內培養(yǎng)基，用 PBS洗滌2次后加入新的培養(yǎng)基，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔A570nm值。

1.3.6 細胞凋亡及半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）檢測

取對數(shù)生長期細胞接種于12 孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)12 h后設對照組（不添加Re-WSP1），0.08 μg/μL Re-WSP1處理12 h組和0.08 μg/μL Re-WSP1處理24 h組，每組設4個復孔。24 h后每孔加入500 μL免疫染色固定液固定2 h，棄去固定液，每孔加入100 μL DAPI染色液避光染色15 min，激光共聚焦顯微鏡（60×）觀察細胞核形態(tài)的變化并拍照。同時隨機挑選5個視野，計算細胞凋亡率。

人結腸癌細胞SW480以4×105個/mL細胞密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后，加入Re-WSP1至終濃度為0.08 μmol/L，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，Western blotting檢測Re-WSP1是否引起SW480細胞內Caspase蛋白表達量發(fā)生變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 編碼WSP基因片段的擴增、克隆與鑒定

圖1 WSP PCR產物Fig.1 PCR products of water stress protein

圖2 表達質粒pET28a-WSP雙酶切電泳圖Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the expression plasmid pET28a-WSP

以地皮菜組織cDNA做模板，根據(jù)天然蛋白測序結果設計特定的引物，通過PCR擴增出WSP基因片段（約1 000 bp）（圖1）。將地皮菜WSP的PCR產物克隆到pET28a中，得到重組質粒pET28a-WSP。經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠電泳圖顯示有5 369 bp和1 000 bp兩個條帶，與pET28a和WSP基因大小相吻合（圖2）。對PCR產物及重組質粒pET28a-WSP進行測序，兩者結果完全相同，基因全長1 014 bp，編碼氨基酸337個（圖1），表明載體構建成功。該基因及蛋白序列已公布于GenBank，序列號為KF003026。

2.2 Re-WSP1的表達、純化

圖3 Re-WSP1表達及SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of Re-WSP1 by SDS-PAGE

將上述重組質粒轉入大腸桿菌BL21，獲得原核表達工程菌pET28a-WSP/BL21。IPTG誘導表達后，SDS-PAGE結果顯示：不加IPTG誘導時，融合表達載體pET28a-WSP不表達目的蛋白；IPTG誘導后，菌株大量表達Re-WSP1蛋白，表達后目的蛋白以可溶性形式存在，分子質量約40 kD，與理論值相符（圖3）。蛋白經Ni-NTA純化后，獲得高純度的Re-WSP1蛋白，經IMAGE J軟件分析其純度在90%以上。在595 nm波長處檢測Re-WSP1質量濃度，計算出400 mL菌液得到脫鹽、濃縮的純化蛋白總量1.236 mg。

2.3 Re-WSP1對結腸癌細胞SW480的生長抑制作用

由圖4可知，用純化后不同質量濃度的Re-WSP1分別處理結腸癌上皮細胞SW480和正常腸上皮細胞FHC 48 h。MTT法檢測SW480和FHC細胞增殖活力，結果表明Re-WSP1在質量濃度為0.08 μg/μL和0.10 μg/μL作用48 h后，對SW480細胞生長具有明顯的抑制（P＜0.01），抑制率分別為58.2%和59.7%；而對人正常結腸組織上皮細胞FHC生長無明顯影響。

圖4 Re-WSP1對SW480和FHC細胞增殖的影響Fig.4 Effects of Re-WSP1 on the growth of SW480 and FHC cells in vitro

2.4 Re-WSP1誘導細胞凋亡結果

用0.08 μg/μL Re-WSP1作用于SW480細胞，并分別于12、24 h對SW480細胞進行DAPI染色，觀察SW480細胞核的變化。由圖5可知，與對照組相比，經Re-WSP1作用12 h后，SW480細胞核出現(xiàn)固縮，有一部分細胞核呈半月形；經Re-WSP1作用24 h后，細胞核出現(xiàn)了典型的凋亡小體，SW480細胞凋亡率為27.3%。Western blotting結果顯示，經Re-WSP1（0.08 μg/μL）處理24 h后，SW480細胞內Procaspase-3、Procaspase-8蛋白被激活，Caspase-3、Caspase-8剪切片段的量顯著增加（圖6），經灰度分析Re-WSP1處理組與對照組相比，Cleaved-caspase-8/Caspase-8和Cleaved-caspase-3/Caspase-3顯著升高。提示Re-WSP1可能是通過激活Caspase而誘導SW480細胞發(fā)生凋亡。

圖5 Re-WSP1誘導結腸癌SW480細胞發(fā)生凋亡Fig.5 Effects of Re-WSP1 on apoptosis in SW480 colon cancer cells

圖6 Re-WSP1誘導SW480細胞Caspase蛋白表達的變化Fig.6 Effects of Re-WSP1 on the expression of caspases in SW480 cells

3 討 論

本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，地皮菜（Nostoc commune Vauch.）中的天然水應激蛋白能夠通過誘導結腸癌細胞凋亡而抑制其增殖。在此基礎上，利用基因工程技術將地皮菜水應激蛋白基因片段克隆到原核表達系統(tǒng)并獲得工程菌pET28a-WSP/BL21。目的蛋白在宿主菌中獲得大量表達，并以可溶性狀態(tài)存在，純化后純度高于90%。整個制備過程簡單高效，無需復雜的處理，消耗試劑的種類均很少，為后續(xù)開發(fā)與生產提供了可能。

圖4實驗結果表明，Re-WSP1能夠抑制結腸癌細胞SW480細胞的增殖，而對于正常結腸上皮細胞FHC生長無明顯抑制作用。同時還發(fā)現(xiàn)，Re-WSP1可以引起SW480細胞的凋亡，該過程伴隨著凋亡細胞一系列的典型改變，包括細胞的核質固縮，產生凋亡小體等（圖 5）。半胱天冬酶（caspase）依賴途徑是細胞凋亡的經典途徑[17]，圖6實驗結果說明Re-WSP1可以通過Caspase依賴途徑誘導SW480細胞凋亡，地皮菜Re-WSP1處理后，上游的Procaspase-8被激活，活化的Caspase-8進一步激活下游的Caspase-3，最終導致細胞的凋亡。以上結果表明，Re-WSP1能夠通過誘導SW480細胞的凋亡而抑制其增殖。對Re-WSP1抗腫瘤作用機制的深入研究，有利于進一步尋找Re-WSP1抑制結腸癌細胞的作用靶點，提高其療效，同時也可以為其他抗腫瘤藥物的篩選提供新的思路。

本實驗成功獲得了一種新型的Re-WSP1。實驗結果顯示，該蛋白可以誘導SW480細胞發(fā)生凋亡,進而抑制結腸癌SW480細胞的增殖，但它對人正常結腸癌上皮細胞卻無明顯抑制作用。該蛋白究竟是通過何種分子機制實現(xiàn)這一功能，作用于細胞的靶點是什么，還需要進一步的深入探討。未來本課題組將對該蛋白進行截短優(yōu)化，應用動物模型進行體內實驗，以期獲得在體內抑癌效果高，免疫反應小，安全性高的活性肽[18-20]，為后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎。

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