吳定濤，巨瑤君，陸靜峰，趙 靜，李紹平*

（澳門大學中華醫(yī)藥研究院，中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門 999078 ）

長裙竹蓀（Dictyophora indusiata）隸屬于擔子菌亞門、鬼筆科、竹蓀屬，被譽為“菌中皇后”，是我國著名的食用菌[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究證實，多糖作為長裙竹蓀的主要活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體免疫力[4]，抑制腫瘤和癌細胞生長[5-6]，抗氧化[7-9]等活性。實際上，多糖的生物活性與其單糖組成及比例、糖苷鍵類型及順序、分子質(zhì)量、粒徑、溶液鏈構象等密切相關[10-12]。因此，為評價長裙竹蓀質(zhì)量，對其多糖進行比較研究是十分必要的。然而，由于多糖結構的復雜性，目前尚無比較不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖的報道。

高效凝膠排阻色譜聯(lián)用多角度激光光散射（high performance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering，HPSEC-MALLS）能夠準確測定多糖分子參數(shù)，包括重均分子質(zhì)量（molecular weight，Mw）及其分布、回旋半徑以及溶液鏈構象等，并已成功用于香菇多糖[13]注射液質(zhì)量評價。另外，糖譜法是我們提出的一種多糖定性定量分析方法[14-17]，糖譜法聯(lián)用熒光輔助凝膠電泳（polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis，PACE）已成功應用于不同來源靈芝多糖、天然蟲草多糖、北蟲草多糖以及手掌參多糖的質(zhì)量研究[18-22]。本研究將結合使用HPSECMALLS和糖譜法聯(lián)用PACE比較研究長裙竹蓀多糖結構特征，提高竹蓀多糖及其產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川宜賓（樣品DI1）、福建莆田（樣品DI2）、四川青川（樣品DI3、DI4、DI5、DI6）共6批來至不同產(chǎn)地長裙竹蓀由無限極（中國）有限公司提供，經(jīng)鑒定為Dictyophora indusiata (Vent.Pers.) Fisch.子實體。

右旋糖酐酶（E C 3.2.1.1 1）、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）和果膠酶（EC 3.2.1.15） 美國Sigma公司；昆布二糖（95%）、昆布三糖（95%）、昆布四糖（95%）、昆布六糖（95%）、β-1,3-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.39）、β-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.6）、β-2,1-菊粉酶（EC 3.2.1.7） 愛爾蘭Megazyme公司；8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽 日本東京化學工業(yè)株式會社；聚丙烯酰胺凝膠 美國伯樂公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

微波輔助提取儀 奧地利安東帕公司；凝膠電泳分析儀 美國伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司；多角度激光光散射、示差檢測器 美國懷亞特公司；紫外檢測器（diode array detector，DAD）、高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；凝膠排阻色譜柱（TSK Gel G6000pwxl和TSK Gel G3000pwxl） 日本東曹公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取長裙竹蓀多糖

樣品經(jīng)干燥、打粉后，采用微波輔助提取儀制備長裙竹蓀子實體粗多糖。分別取1 g樣品進行提取，提取條件為微波功率500 W，溫度120℃，提取時間15 min，料液比1∶20（m/V）。隨后將提取液濃縮至10 mL，加入4倍體積的乙醇（體積分數(shù)95%）沉淀粗多糖。沉淀再用去離子水復溶，高速離心去除水不溶物后，低壓冷凍干燥機凍干上清液，獲得長裙竹蓀多糖。

1.3.2 長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜構建和分子質(zhì)量及其分布測定

采用美國懷亞特示差檢測器（refractive index detector，RID）測定長裙竹蓀多糖比折光指數(shù)增量值（dn/dc），即取粗多糖10 mg，配制成終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的水溶液各3 mL，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用RI-batch模式測得長裙竹蓀多糖dn/dc值為0.145 mL/g。

采用HPSEC-MALLS/RI構建長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜及測定分子質(zhì)量分布，并聯(lián)用DAD在線檢測樣品UV280 nm吸收。色譜條件：流動相為0.9 g/100 mL的氯化鈉水溶液；色譜柱柱溫35℃；流速0.5 mL/min；色譜柱TSK Gel G6000pwxl串聯(lián)TSK Gel G3000pwxl；樣品質(zhì)量濃度約為2.5 mg/mL；進樣量100 μL；采用Astra 6軟件收集及處理數(shù)據(jù)。

1.3.3 長裙竹蓀多糖PACE特征性糖譜構建

1.3.3.1 長裙竹蓀多糖精制

取長裙竹蓀多糖凍干粉末各20 mg，溶于10 mL去離子水中，采用分子截留量為3 000 D的離心超濾管處理樣品，即高速離心超濾（4 000×g，25 min），并重復上述過程步驟5次，以去除樣品中分子質(zhì)量低于3 000 D小分子化合物，再采用苯酚-硫酸法測定總多糖含量[23]，以調(diào)節(jié)用于酸和酶催化水解的多糖樣品量。

1.3.3.2 長裙竹蓀多糖部分酸水解

取超濾處理后的多糖溶液200 μL（約0.5 mg）若干份，加入1.5 mol/L三氟乙酸100 μL，混勻。隨后將混合液置于80℃保溫5 h。反應結束后，采用氮吹干燥儀干燥酸水解產(chǎn)物，并加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，以去除水解產(chǎn)物中殘留的三氟乙酸，干燥產(chǎn)物用于后續(xù)衍生化處理；另以不加三氟乙酸水解的長裙竹蓀多糖溶液為空白對照作平行處理。

1.3.3.3 長裙竹蓀多糖酶水解

取超濾處理后的多糖溶液200 μL（約0.5 mg）若干份，分別加入右旋糖酐酶、β-1,3-葡聚糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、果膠酶、α-淀粉酶和β-2,1-菊粉酶至終濃度為2、2、2、20、20、2 U/mL，隨后將混合液置于40℃保溫12 h。反應結束后，將混合液置于80℃保溫20 min，終止酶催化水解。采用高速離心去除變性后的酶蛋白，隨后在35℃條件下氮吹干燥上清液，獲得多糖酶解產(chǎn)物。另以不添加糖苷水解酶長裙竹蓀多糖溶液作為空白對照。另分別取右旋糖酐70、燕麥葡聚糖、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸各0.5 mg，分別加入右旋糖酐酶、β-葡聚糖苷酶、α-淀粉酶和果膠酶在上述相同條件下反應，酶水解產(chǎn)物作為陽性對照。最后，酶水解產(chǎn)物按之前報道的方法進行衍生化處理[18-19]后分析。

1.3.3.4 長裙竹蓀多糖水解產(chǎn)物電泳分析

熒光輔助凝膠電泳按報道的方法[18-19]進行。即采用垂直板凝膠電泳分離多糖部分酸水解、酶水解產(chǎn)物，分離膠和濃縮膠分別為0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）配制的30 g/100 mL和8 g/100 mL的聚丙烯酰胺凝膠。電泳緩沖液為0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）。上樣量為1～3 μL，首先采用200 V進行電泳分離20 min，隨后采用700 V進行電泳分離45 min。所有的樣品均至少重復電泳分析3次。凝膠在UV365 nm條件下成像。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity-One 軟件（版本4.6.2，美國伯樂公司）掃描PACE凝膠圖上各條帶光密度值，生成電子掃描特征圖譜，隨后采用計算機輔助相似性評價系統(tǒng)（版本1.290，由中南大學中藥現(xiàn)代化研究中心及香港理工大學開發(fā)）創(chuàng)建各電子掃描特征圖譜共有模式圖譜并計算各特征圖譜與共有模式圖譜之間的相關系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜及分子質(zhì)量分布

多糖分子質(zhì)量及其分布、粒徑、溶液鏈構象等與多糖的生物活性密切相關[10]，并且多糖溶液鏈構象已被用于多糖的質(zhì)量控制研究[13,22]。因此，本研究采用HPSECMALLS構建不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜，并準確測定其分子質(zhì)量及分布，研究結果有利于提高長裙竹蓀多糖的質(zhì)量控制。不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜見圖1，重均分子質(zhì)量及其分布見表1。結果表明不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖HPSEC圖譜中均有相似的色譜峰，色譜峰1和2基本無紫外吸收，其分子質(zhì)量及其分布也類似（表1）。由于S E C柱分離能力較弱，分子質(zhì)量相對較小的化合物（分子質(zhì)量小于5 000 D）均在36.5～40.0 min之間洗脫，結果導致色譜峰3分子質(zhì)量不能準確測定（誤差＞15%）。

圖1 不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖HPSEC色譜圖（dRI信號和UV 280 nm吸收）Fig.1 HPSEC chromatograms of polysaccharides in D.indusiata collected from different places of China

表1 不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖分子質(zhì)量及其分布Table1 Molecular weights and their distribution of polysaccharides from D.indusiata

2.2 長裙竹蓀多糖部分酸水解產(chǎn)物特征糖譜

圖2A表明各長裙竹蓀多糖樣品在水解前不含小分子糖類化合物。不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖的部分酸水解產(chǎn)物PACE特征圖譜基本一致（圖2B）。此外，采用Quantity-One軟件采集PACE特征圖譜中各條帶光密度值，構建部分酸水解產(chǎn)物掃描圖，并用計算機輔助相似性評價系統(tǒng)計算部分酸水解產(chǎn)物掃描圖共有模式圖譜，同時計算各樣品與共有模式之間相似度。結果：不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖部分酸水解產(chǎn)物與其共有模式之間的相關系數(shù)值見表2，平均相關系數(shù)值為0.957±0.039（n = 6），提示不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖具有相似的部分酸水解特征。然而酸水解選擇性差，特異性酶水解有利于研究長裙竹蓀多糖化學結構特征。

表2 長裙竹蓀多糖與其共有模式相關系數(shù)Table2 Correlation coefficient of each sample of D.indusiiaattaa to their simulative mean chromatogrraamm

2.3 長裙竹蓀多糖酶水解產(chǎn)物特征性糖譜

糖譜法是針對多糖結構特征建立的一種特異性強、選擇性高的表征多糖化學特征性圖譜的新方法[14]，糖譜法聯(lián)用PACE具有高效分離能力和高通量處理能力等優(yōu)勢[18-19]，并且熒光標記檢測具有很高的靈敏度，明顯優(yōu)于常用的示差檢測器和蒸發(fā)光檢測器[10]。因此，本實驗采用糖譜法結合PACE方法分析比較不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖6種酶水解產(chǎn)物，PACE特征性圖譜見圖3。結果表明：不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖均能被β-1,3-葡聚糖苷酶（圖3A）、β-葡聚糖苷酶（圖3B）、α-淀粉酶（圖3C）、右旋糖酐酶（圖3D）、β-2,1-菊粉酶（圖3E）以及果膠酶（圖3F）催化水解成小分子糖類化合物，說明長裙竹蓀多糖含有β-1,3-葡萄糖苷鍵，β-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,6-葡萄糖苷鍵、β-2,1-果糖苷鍵和α-1,4-半乳糖醛酸苷鍵等。此外，長裙竹蓀多糖α-淀粉酶水解產(chǎn)物與可溶性淀粉水解產(chǎn)物不同（圖3C），且長裙竹蓀多糖對碘-碘化鉀試液不顯色，說明長裙竹蓀多糖中的α-1,4-葡萄糖苷鍵不是源自淀粉類化合物。表2總結了不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖酶解產(chǎn)物與其共有模式之間的相關系數(shù)值，結果進一步證實不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖十分相似（平均相關系數(shù)值均大于0.95）。

圖3 不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖酶解產(chǎn)物PACE特征性圖譜Fig.3 PACE fingerprints of enzymatic hydrolysates of polysaccharides from D.indusiata

3 結 論

不同產(chǎn)地長裙竹蓀多糖具有很高的相似性，長裙竹蓀多糖含有β-1,3-葡萄糖苷鍵，β-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,6-葡萄糖苷鍵、β-2,1-果糖苷鍵和α-1,4-半乳糖醛酸苷鍵等。本研究結果有利于表征竹蓀多糖的化學特征，提高長裙竹蓀多糖質(zhì)量控制。

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