孫京沙，張朝輝*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

大葉藻（Zostera marina L.）是單子葉植物，隸屬于眼子菜大葉藻屬 ，地方名為海馬藺、海帶草、海苫房草[1]，分布于我國(guó)河北、遼寧和山東等沿海地區(qū)，朝鮮、日本、俄羅斯等地也有分布。大葉藻屬于多年生草本植物，作為海草床的一部分，對(duì)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性有重要作用，同時(shí)也具有一定的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)大葉藻的研究相對(duì)較少，主要集中在形態(tài)、生態(tài)作用、抗鹽機(jī)理等方面[2-4]。國(guó)外學(xué)者對(duì)大葉藻的研究較多，在生理[5-6]、生態(tài)繁殖[7]、海草床恢復(fù)[8-10]等方面都比較深入。

黃酮類化合物泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A-環(huán)與B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物[11]。黃酮類化合物又稱生物類黃酮，廣泛地存在于植物的葉、花、果實(shí)等各個(gè)部位，是一類植物次生代謝產(chǎn)物[12]，具有抗氧化[13]、降血糖[14]、降血脂[15]等多種生物功效。大葉藻中總黃酮化合物，在國(guó)內(nèi)外已有研究，黃媛媛[16]、Jin等[17]對(duì)大葉藻中總黃酮的結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性作了相關(guān)的研究，黃媛媛主要對(duì)鑒定了大葉藻乙酸乙酯相中的每個(gè)黃酮化合物個(gè)體結(jié)構(gòu)，而本實(shí)驗(yàn)是對(duì)大葉藻總黃酮進(jìn)行純化。

大孔吸附樹脂的原理是選擇性吸附中藥及其復(fù)方的有效成分，從而達(dá)到提取精制的目的。與傳統(tǒng)吸附劑相比，它具有選擇性好、吸附容量大、解吸容易、機(jī)械強(qiáng)度高、耐污染、可以多次反復(fù)使用、再生比較容易等優(yōu)點(diǎn)。目前已被廣泛應(yīng)用于多種植物黃酮類化合物的分離提純中[18-19]。

目前大葉藻不被充分利用，完全未發(fā)揮其在營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的價(jià)值，在一些沿海區(qū)域只是利用大葉藻來(lái)建造海草房，用海草來(lái)構(gòu)建房屋的房頂。黃酮化合物已引起了國(guó)內(nèi)外專家人士的廣泛關(guān)注，研究方法也已日趨成熟，但是對(duì)于黃酮化合物的開發(fā)一般只限于陸生的高等植物，海洋中的植物還沒(méi)有充分開發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)主要就海洋中的高等植物——大葉藻，利用大孔吸附樹脂純化其中的黃酮化合物，為大葉藻黃酮類化合物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉藻采于山東青島棧橋附近海，將采回的大葉藻用自來(lái)水沖掉泥沙，清水浸泡5 h除去草面的鹽。撈出后除去表面附著物，風(fēng)干表面水分，后放入55℃烘箱烘干。將烘干的大葉藻用搗碎機(jī)研磨成粉末，過(guò)40 目篩，保存于陰暗干燥處備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 南京替斯艾么中藥研究所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純；D101-1、D101、DM130、DM301、AB-8大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-B恒溫振蕩器 江蘇常州國(guó)華電器有限公司；722s可見(jiàn)光分光光度計(jì)、pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限責(zé)任公司；DHG-903電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；恒流泵 保定蘭格恒流泵有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器 上海青浦瀘西儀器制造廠。

1.3 方法

1.3.1 大葉藻總黃酮的提取

稱取大葉藻粉末，按料液比1∶30（g/mL）的比例加入蒸餾水，80℃浸提3次，每次1 h，離心合并上清液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度（1.25 mg/mL），冷藏備用。

1.3.2 大葉藻總黃酮含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照文獻(xiàn)[20]配制一定梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C/（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：A=13.392 9C－0.006 7，R2=0.999 9。

1.3.2.2 上樣液總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定

取適量上樣液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，帶入回歸方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度。

1.3.2.3 樣品純度的測(cè)定

精確稱取一定量?jī)龈珊蟮臉悠贩勰谜麴s水溶解并定容至25 mL，取適量溶液按照上述操作測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮質(zhì)量濃度，并按照式（1）計(jì)算凍干樣品中總黃酮的純度。

式中：c為液體中黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL)；V為液體體積/mL；m為稱取的凍干樣品的質(zhì)量/mg。

1.3.3 大孔吸附樹脂預(yù)處理

按照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行預(yù)大孔吸附樹脂預(yù)處理，備用。

1.3.4 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.4.1 靜態(tài)吸附和解吸

稱取1.0 g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的各樹脂，置于100 mL的錐形瓶中，加入大葉藻總黃酮上樣液30 mL，密封，恒溫（25℃）振蕩24 h，取上清液，測(cè)定樣品中總黃酮的平衡時(shí)質(zhì)量濃度，并按式（2）（3）計(jì)算各種樹脂對(duì)大葉藻總黃酮的吸附量和吸附率。將上述充分吸附后的樹脂過(guò)濾，置于錐形瓶中，再加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇30 mL，密封后，恒溫（25℃）振蕩，解吸24 h，過(guò)濾，測(cè)定洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度，并按式（4）（5）計(jì)算各種樹脂的靜態(tài)解吸率和總黃酮的回收率。

式中：C0為上樣液起始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C1為上樣液平衡質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C2為洗脫液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為吸附液體積/mL；V2為洗脫液體積/mL；M為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.4.2 靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)

取預(yù)處理好的大孔樹脂1.0 g于100 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入大葉藻總黃酮上樣液30 mL，密封，恒溫 （25℃）振蕩24 h，以大孔樹脂與上樣液接觸為0時(shí)刻，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)定樣液剩余總黃酮的質(zhì)量濃度。以樹脂對(duì)黃酮吸附量對(duì)時(shí)間作圖，繪制大孔樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附曲線。

吸附24 h后，將樹脂過(guò)濾，放入錐形瓶中，加入乙醇，搖勻，密封，恒溫（25℃）振蕩24 h，每隔一定時(shí)間取解吸液，測(cè)定解吸液的總黃酮質(zhì)量濃度，以洗脫液總黃酮質(zhì)量濃度對(duì)時(shí)間作圖，繪制大孔樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)解吸曲線。

1.3.4.3 混合樹脂的吸附與解吸

根據(jù)文獻(xiàn)[22]，將上述方法選出的最優(yōu)的兩種樹脂按照不同的比例混合，準(zhǔn)確稱取1.0 g放入錐形瓶中，量取質(zhì)量濃度相同大葉藻總黃酮溶液進(jìn)行吸附和解吸，計(jì)算不同比例混合樹脂的吸附率和解吸率，比較其吸附和解吸效果。

1.3.5 不同條件下大孔吸附樹脂對(duì)大葉藻總黃酮純化工藝的影響

用篩選出的最佳混合比例的大孔吸附樹脂進(jìn)行大葉藻總黃酮純化工藝的研究。通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，分別考察上樣液pH值、上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂解吸性能的影響；通過(guò)動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，分別考察上樣量、上樣流速對(duì)樹脂吸附性能的影響，洗脫體積、洗脫流速對(duì)解吸性能的影響。

1.3.6 工藝驗(yàn)證

按照上述所確定的最佳純化大葉藻總黃酮的吸附和解吸條件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將洗脫液旋蒸濃縮后，冷凍干燥。測(cè)定并計(jì)算凍干樣品中總黃酮的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉藻總黃酮含量測(cè)定

未經(jīng)純化的大葉藻總黃酮凍干后，經(jīng)測(cè)定，純度為（12.66±0.42）%。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選

2.2.1 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

依據(jù)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)中，大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率來(lái)選擇樹脂型號(hào)，吸附樹脂是利用吸附的可逆性分離植物有效成分。由于樹脂極性不同，解吸的難易程度也不同，故解吸率也是篩選大孔樹脂的又一關(guān)鍵因素[23]。

表1 5種不同樹脂對(duì)大葉藻總黃酮的吸附和解吸效果Table1 Results of adsorption and desorption for flavonoids from Zostera marina L.by five macroporous resins

由表1可知，在樹脂用量相同的情況下，各樹脂對(duì)大葉藻總黃酮的吸附和解吸效果不一。其中，D101-1型樹脂對(duì)大葉藻總黃酮的吸附率最高，達(dá)（58.08±0.49）%，而解吸率最高的是AB-8型樹脂，達(dá)（92.39±1.27）%，總黃酮回收率由高到低樹脂依次是D101-1、AB-8。因此，本實(shí)驗(yàn)預(yù)將采用D101-1樹脂和AB-8樹脂按一定比例混合作為大葉藻總黃酮的純化樹脂，希望可以選擇出分離純化大葉藻總黃酮效果最好的混合樹脂比例。

2.2.2 靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

僅用樹脂的平衡吸附量、吸附率和解吸率來(lái)評(píng)價(jià)其吸附和解吸性能是不全面的，合適的樹脂不僅具有較大的吸附量，良好的解吸率，同時(shí)應(yīng)該具有較快的吸附速率和解吸速率，所以又研究其靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)和解吸動(dòng)力學(xué)特性。由圖1和圖2可知，D101-1和AB-8兩種大孔樹脂對(duì)大葉藻總黃酮的吸附和解吸都可視為快速平衡型。從圖1可知，在起始階段，吸附量增加較快，在7 h時(shí)基本接近平衡。7 h時(shí)，D101-1和AB-8的吸附量分別為19.17 mg/g和15.85 mg/g。從圖2可知，在解吸過(guò)程中，4 h以后，洗脫液中的總黃酮質(zhì)量濃度增加趨勢(shì)很緩慢，說(shuō)明4 h時(shí)，解吸基本接近平衡。

圖1 D101-1和AB-8兩種大孔樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of D101-1 and AB-8 macroporous resins

圖2 D101-1和AB-8兩種大孔樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)解吸曲線Fig.2 Static desorption curves of D101-1 and AB-8

綜合以上分析可知，兩種吸附樹脂吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線的走向趨勢(shì)基本一致。在吸附實(shí)驗(yàn)，7 h時(shí)基本達(dá)到平衡狀態(tài)；解吸實(shí)驗(yàn)中，在4 h時(shí)基本達(dá)到平衡狀態(tài)。所以，在下述的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)中，將選擇7 h作為吸附時(shí)間，4 h作為解吸時(shí)間。

2.3 混合樹脂的吸附與解吸

表2 不同混合比例樹脂的吸附與解吸對(duì)比Table2 Comparison of adsorption and desorption capacities of D101-1:AB-8 mixtures in different proportions

從表2可以看出，吸附率較高的D101-1與AB-8大孔樹脂質(zhì)量比為2∶3、1∶1；而解吸率較高的D101-1與AB-8大孔樹脂質(zhì)量比為3∶2、2∶3。對(duì)效果較好的樹脂選用總黃酮回收率進(jìn)行考察，綜合考慮，確定D101-1和AB-8質(zhì)量比2∶3混合作為大葉藻總黃酮的樹脂材料。

2.4 不同條件對(duì)大孔吸附樹脂純化大葉藻總黃酮工藝的影響

2.4.1 上樣液pH值對(duì)吸附率影響

圖3 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample pH on adsorption rate

由圖3可知，在酸性環(huán)境下，大孔樹脂吸附率高于中性環(huán)境，當(dāng)溶液pH值為3時(shí)，大孔樹脂對(duì)大葉藻總黃酮有最佳吸附率，0.5 g的大孔樹脂的吸附率是（36.23±2.09）%。這是因?yàn)辄S酮為多羥基酚類，呈弱酸性，故在酸性或弱酸性條件下易被吸附，而酸性過(guò)強(qiáng)時(shí)黃酮分子易形成佯鹽，偏堿性時(shí)黃酮分子羥基去離子化，黃酮化合物形成離子型結(jié)構(gòu)，故都不易被吸附[24]。因此，選樣品溶液pH值為3作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.4.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

樹脂吸附目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，存在著一個(gè)吸附平衡，該平衡和料液質(zhì)量濃度有很大的關(guān)系。尤其是當(dāng)樹脂的吸附平衡是受液膜擴(kuò)散控制時(shí)，料液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附平衡影響更大[25]。黃建明等[26]研究表明如果上樣液濃度過(guò)低提純時(shí)間增加，效率降低；上樣液質(zhì)量濃度過(guò)高則泄漏早，處理量小，樹脂的再生周期短。

圖4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.4 Effect of sample concentration on adsorption properties

由圖4可知，隨著溶液的質(zhì)量濃度增加，大孔樹脂的吸附率逐漸降低，吸附量先增長(zhǎng)后趨于平緩。當(dāng)大葉藻總黃酮溶液的質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，黃酮吸附量的增加率最大，吸附量也基本達(dá)到飽和，所以從節(jié)約黃酮溶液和樹脂的角度考慮，選擇最適上樣質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL。

2.4.3 洗脫劑對(duì)解吸率的影響

大孔樹脂常用的洗脫劑是低級(jí)醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)安全性等方面要求，本實(shí)驗(yàn)使用乙醇作為洗脫劑[27]。由于乙醇毒性低，易于回收，選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為洗脫溶劑。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption rate

充分吸附后的樹脂，用不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖5所示，隨著洗脫劑濃度體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率也在不斷的升高，當(dāng)洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)接近70%時(shí)，對(duì)大葉藻總黃酮的解吸率較高，解吸率可達(dá)到92.61%；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，解吸率逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

2.4.4 最佳上樣量的確定

取大葉藻總黃酮的上樣液若干，以2 BV/h的流速通過(guò)層析柱，每0.5 BV為一個(gè)收集段，測(cè)定每段收集液中總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 總黃酮的泄露曲線Fig.6 Leakage curve of flavonoids

如圖6所示，當(dāng)上樣量為6 BV時(shí)，總黃酮的泄漏率開始明顯的增加，上樣量越大，流出液中大葉藻總黃酮質(zhì)量濃度越大，浪費(fèi)原料；反之，上樣量太小，樹脂處理量較小，工作效率低。綜合考慮，應(yīng)選擇上樣量為6 BV。

2.4.5 最佳上樣流速的確定

分別以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的流速，上樣6 BV，質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的上樣液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用4 BV蒸餾水洗柱，并將吸附過(guò)程的流出液和水洗液收集在一起作為吸附殘液，記錄殘液體積，測(cè)定殘液總黃酮吸光度，計(jì)算吸附總量，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 上樣流速對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.7 Effect of sample laoding flow rate on adsorption quantity

由圖7可知，隨著吸附流速增加，樹脂吸附量逐漸下降。流速過(guò)快，會(huì)提前泄漏；流速低，有利于總黃酮的充分吸附，但會(huì)影響生產(chǎn)效率，使生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，成本增加。流速在1～3 BV/h時(shí)，吸附總量均大于70 mg。綜合考慮下，選擇上樣流速為3 BV/h即可。

2.4.6 最佳洗脫體積的確定

按確定的最佳吸附條件上柱，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，以2 BV/h的流速洗脫，每0.5 BV為一個(gè)收集段收集洗脫液，檢測(cè)每段收集液中總黃酮的質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 洗脫曲線Fig.8 Dynamic desorption curve

由圖8可知，當(dāng)洗脫體積到達(dá)3.5 BV后，洗脫液質(zhì)量濃度接近0且基本不再變化，說(shuō)明3.5 BV基本洗脫完全，但為了保證樹脂吸附的總黃酮徹底洗脫下來(lái)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將用5 BV作為最佳的洗脫體積。

2.4.7 最佳洗脫流速的確定

按確定的最佳吸附條件上柱，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，以2 BV/h的流速洗脫，用70%的乙醇溶液分別按1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h的速率進(jìn)行洗脫，洗脫液用量為5 BV。測(cè)定洗脫液總黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 洗脫流速對(duì)樹脂解吸性能的影響Fig.9 Effect of elution flow rate on desorption rate

由圖9可知，由于洗脫體積都是用的5 BV，所以洗脫流速對(duì)解吸率的影響不大，流速在小于等于3 BV/h時(shí)，解吸率都在90%之上，故為了保證洗脫時(shí)間不至過(guò)長(zhǎng)，選用3 BV/h作為最佳洗脫流速。

2.5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)，確定的大葉藻總黃酮純化的最佳工藝條件為D101-1和AB-8大孔吸附樹脂質(zhì)量比2∶3、上樣量6 BV、上樣流速3 BV/h、上樣液pH 3、上樣液質(zhì)量濃度1.25 mg/mL、洗脫液體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、洗脫體積5 BV、洗脫流速3 BV/h，在以上條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)純化后，樣液中的總黃酮回收率可達(dá)到（59.47±0.68）%，凍干樣品純度由原來(lái)的（12.66±0.42）%上升至（51.25±1.26）%。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定該條件可行，可作為工業(yè)生產(chǎn)的參考工藝。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)5種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂和混合樹脂的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，研究了大葉藻總黃酮的純化工藝條件，實(shí)驗(yàn)表明：D101-1和AB-8大孔吸附樹脂以2∶3比例混合、上樣量6 BV、上樣流速3 BV/h、上樣液pH 3、上樣液質(zhì)量濃度1.25 mg/mL、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、洗脫體積5 BV、洗脫流速3 BV/h，凍干后總黃酮的純度由原來(lái)的（12.66±0.42）%上升至（51.25±1.26）%，提高接近4倍，本研究結(jié)果為大葉藻總黃酮的純化提供新方法，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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