劉 影 于 濤 林 偉 鄔恒夫

心肌梗死發(fā)生率和病死率呈逐年上升的趨勢，盡管各種治療方法在不斷發(fā)展，由心肌梗死導致的難以治療的心力衰竭及死亡仍然是全球面臨的難題。近年出現的干細胞治療心肌梗死成為研究的熱點，各種監(jiān)測干細胞轉歸的方法中又以核素的報告基因顯像最有發(fā)展前途。

鈉/碘轉運體(sodium/iodide symporter，NIS)是正常甲狀腺細胞的一種跨膜糖蛋白，介導碘的主動攝取，成為目前報告基因顯像研究中最有發(fā)展前景的報告基因。已有大量研究以NIS作為報告基因的心臟干細胞顯像研究，其存在的主要問題是轉染心肌細胞后表達量較低，應用于臨床實踐受到限制，其中改善的主要方法包括應用組織特異性啟動子來增加心肌組織靶向調控NIS基因的表達。肌凝蛋白輕鏈蛋白-2(myosin light chain-2，MLC-2p)為心肌特異性啟動子。本研究構建了MLC-2p啟動子調控的rNIS基因重組腺相關病毒(recombinant adenoassociated virus，rAAV)并感染心肌細胞，通過細胞水平的碘攝取實驗，在體外證實NIS作為報告基因的可行性，為下一步的MLC-2p啟動子調控的rNIS基因介導干細胞治療心肌梗死的體內實驗打下基礎，現報道如下。

材料與方法

1．材料:載體質粒 pAAV-IRES-ZsGreen，JM109 感受態(tài)及HET kit(深圳百恩維生物科技有限公司)，乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室保存，小量質粒抽提試劑盒及Trans2K PlusⅡ DNA Marker(北京全式金生物公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega公司)，DNA引物合成及測序，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，胰蛋白酶Trypsin 0．25%EDTA(美國Invitrogen公司)，限制性內切酶EcoRⅠ，MluⅠ，SpeⅠ及T4 DNA Ligase(美國NEB公司)，大規(guī)模質粒抽提試劑盒(德國Qiagen公司)，Bio-Rad DNA電泳系統(tǒng)，Sub-Cell GT Cell電泳槽，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，超低溫冰箱(-80℃)，UTL2186-6V(美國Thermo公司)，超凈工作臺BCM-1600A(蘇州蘇凈安泰公司)，落地式培養(yǎng)搖床(美國Thermo公司)，超微量高精度分光光度計Nanodrop ND-2000(美國Thermo公司)，METTLER PH 計 SevenMulti，S40(德國 METTLER TOLEDO公司)，Na125I為北京原子高科股份有限公司產品。SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計數器(105103)為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產品。正常SD大鼠乳鼠(1～3天齡)，雌雄不拘，由廣東省動物實驗中心提供。

2．方法:(1)pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen載體質粒構建:載體質粒pAAV-IRES-ZsGreen及目的基因rMLC-2p的EcoRⅠ+MluⅠ雙酶切，分別回收質粒pAAV-IRESZsGreen酶切大片段和目的基因酶切產物并連接，連接產物與100μl JM109感受態(tài)細菌混勻轉化，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，并分別用EcoRⅠ+MluⅠ做酶切鑒定，可得到pAAV-rMLC-2p-ZsGreen載體質粒。同法，載體質粒pAAV-rMLC-2p-IRES-ZsGreen及目的基因rNIS的EcoRⅠ+SpeⅠ雙酶切，分別回收質粒pAAV-IRES-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切產物并連接，連接產物轉化，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，并分別用MluⅠ+SpeⅠ做酶切鑒定，可得到pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen載體質粒。同法構建pAAV-CMV-rNIS-ZsGreen載體質粒。(2)重組腺相關病毒包裝及效價測定:用胰酶消化收集293AAV細胞，以適當完全培養(yǎng)基稀釋細胞至2×106/ml。接種2．5ml細胞稀釋液至10cm培養(yǎng)皿，添加培養(yǎng)基至10ml。將細胞置于含5%，CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育8～24h，當細胞貼壁后即可開始轉染。轉染前2h換液。用HET轉染試劑盒轉染目的質粒到細胞，按試劑盒說明書操作。獲得rAAV9-rMLC-2p-rNIS及對照病毒rAAV9-CMV-rNIS。(3)乳鼠原代心肌細胞及MCF-7細胞培養(yǎng):無菌條件下取SD大鼠乳鼠心室肌，PBS中漂洗3次，剪成約1mm3的小塊，加入膠原酶溶液(每克心肌組織約10ml)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育消化，5h后將細胞懸液離心(800r/min，7min)，并用含10%新生牛血清的DMEM-F12漂洗兩次，收集心肌細胞，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，1h后經差速貼壁法去除成纖維細胞，再接種入合適培養(yǎng)板?？色@得心肌細胞純度為(93．12±1．38)%。MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM-F12中，加入濃度100U/ml青鏈霉素雙抗，于37℃，體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)重組腺相關病毒轉染心肌細胞及MCF-7細胞:心肌細胞及MCF-7細胞均勻接種于24孔板，培養(yǎng)至細胞數為5×105/孔時準備轉染。rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS以感染復數(multiplicity of infection，MOI=50)分別轉染兩種細胞并孵育，6h后將病毒液替換為含10%新生牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h用于后續(xù)實驗。空白對照組以等體積PBS代替病毒液，其他實驗條件與實驗組相同。(5)Na125I的動態(tài)攝取實驗:已轉染病毒的心肌細胞及MCF-7細胞，棄培養(yǎng)液，冰 PBS洗2次，每孔加入含Na125I18．5kBq的DMEM完全培養(yǎng)基0．5ml，在37℃，體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5、10、20、30、60、90 和 120min 時，棄培養(yǎng)液，用冰PBS洗2次，加入 0．3mol/L NaOH 裂解細胞 0．5ml(冰上操作)，收集裂解液至測量管。用SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計數器測量各管的每分鐘放射性計數(count per minute，CPM)值。每種病毒每個時間點設3個復孔。(6)測定細胞的NaClO4抑制情況:心肌細胞接種于24孔板，培養(yǎng)至細胞數為5×105/孔時，加入MOI=50的rAAV9-rMLC-2prNIS孵育，6h后將病毒液替換為含10%新生牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h，每孔加入含 Na125I18．5kBq的 DMEM完全培養(yǎng)基0．5ml，實驗分兩組，一組每孔含50μmol/L的Na-ClO4，另一組不加入NaClO4。37℃，體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。棄培養(yǎng)液，冰PBS洗2次，裂解細胞并測量放射性。每組設3個復孔。

3．統(tǒng)計學方法:用SPSS 13．0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，所有數據用方差分析進行比較，P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．重組腺相關病毒鑒定:經EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切，并連接，轉化后小量抽提質粒，并分別用EcoRⅠ和MluⅠ酶切鑒定，結果顯示陽性克隆可酶切到275bp的條帶，與rMLC-2p啟動子片段大小相符。經EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切，并連接，轉化后小量抽提質粒，并分別用MluⅠ和SpeⅠ酶切鑒定，結果顯示陽性克隆可酶切到2100bp的條帶，與rNIS基因的片段大小相符，提示pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRESZsGreen載體質粒構建成功(圖1)。

圖1 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen酶切鑒定結果

2．rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS重組腺相關病毒包裝后綠色熒光信號的觀察及效價測定:rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS轉染293AAV細胞，觀察細胞綠色熒光表達(圖2)。初次收集病毒效價低，需多次反復感染293AAV細胞，隨著病毒效價的增加，293AAV細胞出現病變現象時間縮短，一般在感染后24h即可見細胞病變現象，細胞腫脹、變圓、脫落、聚集成團。48h可見大多數細胞有綠色熒光。效價測定結果為 rAAV9-rMLC-2p-rNIS 2．46 ×1012μg/ml，rAAV9-CMV-rNIS 4．21 ×1012μg/ml。

圖2 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen

3．Na125I的動態(tài)攝取實驗:(1)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細胞組Na125I攝取的攝取隨時間逐漸增加，30min達高峰，隨后進入平臺期。故后面的攝取實驗均采用30min的孵育時間。(2)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細胞的Na125I攝取明顯高于MCF-7細胞，感染rAAV9-rMLC-2prNIS的MCF-7細胞Na125I攝取與對照組PBS相似，證實了rMLC-2p啟動子的心肌特異性。(3)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌細胞攝碘曲線相似，但CMV啟動子介導的NIS攝取峰值較rMLC-2p啟動子介導的低，進一步證實了rMLC-2p啟動子的心肌特異性。(4)PBS對照組未見明顯的Na125I攝取(圖3)。

圖3 Na125I動態(tài)攝取實驗時間-放射性曲線

4．NaClO4抑制實驗:經轉染的心肌細胞在18．5kBq Na125I的環(huán)境中孵育30min后，轉染組在加入NaClO4的情況下，心肌細胞攝碘明顯受抑制(F=2894．3，P ＜0．05)，抑制率約為 90．3% ～92．5%，表明心肌細胞表達的NIS蛋白具有被NaClO4抑制的特性(圖4)。

圖4 NaClO4抑制碘攝取實驗

討 論

自從1996年大鼠和人類的NIS基因被克隆后［1］，其分子特征得到了廣泛的研究，更成為近年來基因和干細胞治療人類各種難治性疾病中報告基因監(jiān)測中最有發(fā)展前途的報告基因［2］。已有大量研究證實NIS報告基因在心臟疾病的可行性［3～5］。Terrovitis等［3］的研究結果沒有對細胞的存活、增殖、心臟原性的動作電位和血管生成能力產生不利的影響。另外，體外分析也證實Ad-NIS基因轉導后無任何心肌的損傷或無功能［4］。

在心臟干細胞治療中，高的轉染效率及安全的載體是非常必要的，目前應用的載體主要有病毒載體和非病毒載體。應用病毒介導轉導法是迄今在轉干細胞入心臟中應用得最多的轉導載體。rAAV的優(yōu)點在于:可持續(xù)性，可確保長期穩(wěn)定指導轉基因表達，不編碼病毒蛋白，為非免疫原性及可轉導像心肌這樣的非分裂性細胞等，對人類相對較安全，因而更適合作為人類心梗干細胞移植治療的轉導載體［6］。

治療干細胞的組織特異性表達是干細胞治療中的關鍵問題之一。啟動子是報告基因的轉錄控制元件，能啟動和調節(jié)報告基因表達，可分為持續(xù)的啟動子、可誘導的啟動子及組織特異性啟動子。組織特異性啟動子的應用能調控目的基因在特定的組織或腫瘤中表達，實現藥物的組織特異性毒性效應最大化并降低不良反應。目前應用組織特異性啟動子如前列腺特異抗原(PSA)啟動子、Egr-1啟動子、上皮黏蛋白(MUCI)啟動子、免疫球蛋白啟動子和增強子、CEA啟動子、降鈣素啟動子、hTERT核心啟動子等靶向調控人 NIS基因的表達介導131I治療腫瘤［7～13］。心臟組織特異的啟動子MLC-2p可選擇性的在心肌組織表達，減少心臟外(包括甲狀腺和胃)的活性，從轉錄水平調控NIS在心臟的表達。

本研究證實了rAAV9-rMLC-2p-rNIS構建成功，并在體外心肌細胞特異性高表達，可以介導NIS的攝碘特性，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細胞的 Na125I攝取明顯高于 MCF-7細胞，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌細胞攝碘曲線相似，但CMV啟動子介導的NIS攝取峰值較rMLC-2p啟動子介導的低，證實了rMLC-2p啟動子的心肌特異性，且NaClO4能特異性地抑制心肌細胞對碘的攝取，證實轉染細胞表達的rNIS蛋白是有功能的。為進一步以MLC-2p為啟動子，調控的rNIS基因的重組腺相關病毒的體內實驗打下基礎。

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3 Terrovitis J，Kwok KF，Lautam?ki R，et al．Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography［J］．J Am Coll Cardiol，2008，52(20):1652-1660

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