才仁卓瑪 扎洛 李蘭英

青海紅十字醫(yī)院（西寧，810000）

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，占婦科惡性腫瘤之首，在發(fā)展中國(guó)家及發(fā)達(dá)國(guó)家的少數(shù)民族中發(fā)病率較高，可能與這些民族的文化差異、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、衛(wèi)生條件差異、缺乏健康知識(shí)等因素有一定的關(guān)系。人乳頭瘤病毒（HPV）感染已被證明是宮頸癌的直接病因，HPV誘發(fā)宮頸癌通常要經(jīng)歷感染、感染長(zhǎng)期持續(xù)、誘發(fā)癌前病變、進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的過程［1］。世界范圍內(nèi)的研究結(jié)果顯示，不同 HPV亞型在不同地區(qū)和不同種族中存在差異，對(duì)不同種族人群致癌性的強(qiáng)弱也明顯不同［2］。本研究旨在通過對(duì)高原地區(qū)181例藏族宮頸癌患者HPV型別分布進(jìn)行分析，為高原地區(qū)宮頸癌防治、HPV疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2010年3月～2013年9月在本院診斷為宮頸癌的藏族婦女宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本作為研究標(biāo)本，患者來自本省6個(gè)藏族自治州（即玉樹、果洛、海南、海北、海西、黃南）及部分海東地區(qū)，共181例。均為農(nóng)牧民，年齡26～70歲，平均年齡42歲。宮頸鱗癌177例，腺癌4例。

1.2 儀器與試劑

多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（KP－CT48）、Hybri－Max醫(yī)用核酸分子快速雜交儀、HPV DNA提取試劑盒和HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自凱普生物化學(xué)有限公司。對(duì)所有宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行21種HPV亞型檢測(cè)［4］，包括15種高危型 HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）和6種低危型 HPV（HPV 6、11、42、43、44、CP8304）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集及保存 用棉拭子先除去宮頸口處多余的分泌物，用凱普專用宮頸刷伸入宮頸內(nèi)2～3cm處轉(zhuǎn)動(dòng)3～5圈，取出宮頸刷放入含有細(xì)胞保存液的帶蓋樣本管中，放置4℃冰箱中，在2周內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2 樣本DNA提取及PCR擴(kuò)增 宮頸刷頭充分漂洗，洗脫液，離心，棄上清液保留管底細(xì)胞，加入裂解液按試劑盒說明書提取DNA，抽提好的DNA樣本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR Mix、Tap酶和DNA模板按試劑盒說明書要求混勻，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μl，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照，常規(guī)PCR反應(yīng)，退火溫度55℃，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 導(dǎo)流雜交 雜交儀及雜交液45℃預(yù)熱后，在雜交平臺(tái)上放入標(biāo)記有21種HPV基因型寡核苷酸探針的低密度基因芯片，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加熱變性冰浴后，加入檢測(cè)孔內(nèi)進(jìn)行導(dǎo)流雜交；用封阻液封閉膜，排除封阻液后加入酶標(biāo)液，25℃溫育3.5min。用沖洗緩沖液徹底沖洗膜后加入NBT/BOIP底物顯色3～5min。在顯色后1h內(nèi)分析結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判斷 肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性點(diǎn)呈現(xiàn)清晰的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，根據(jù)HPV分型分布圖判斷HPV亞型，如果出現(xiàn)≥1個(gè)HPV分型點(diǎn)則為單一或多重HPV感染，高危型HPV陽(yáng)性或高危型和低危型HPV同時(shí)陽(yáng)性者均視為高危型HPV感染，僅低危型HPV陽(yáng)性者視為低危型HPV感染。生物素對(duì)照點(diǎn)（Biotin，反映酶與顯色液反應(yīng)）和內(nèi)對(duì)照點(diǎn)（IC，質(zhì)控模板DNA探針）出現(xiàn)陽(yáng)性，表示結(jié)果正確。肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，多個(gè)圓點(diǎn)陽(yáng)性即為多重感染。每張芯片上有PCR反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個(gè)。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況

181例藏族宮頸癌患者中HPV陽(yáng)性170例，感染率為93.92%（170/181）。其中單一感染者156例，均為高危亞型感染，占宮頸癌患者的86.19%（156/181），占 HPV 陽(yáng)性宮頸癌患者的 91.76%（156/170）；HPV多重感染者14例，占宮頸癌患者的7.73%（14/181），占 HPV 陽(yáng)性宮頸癌患者的8.24%（14/170）。

2.2 HPV各亞型分布

181例宮頸癌樣本中，檢測(cè)出13種HPV亞型（12種高危亞型和1種低危亞型）。HPV各亞型出現(xiàn)的頻率排序：16 型 71.18% （121/170）、58 型14.71% （25/170）、52 型 5.29% （9/170）、18 型4.71%（8/170）、53型4.12%（7/170）、39型2.35%（4/170）、45型1.76%（3/170）、66和68型1.18%（2/170）、33、35、59和6型0.59%（1/170）。

2.3 HPV多重感染各亞型分布

181例宮頸癌樣本中，單一感染156例，占HPV陽(yáng)性宮頸癌患者的91.76%（156/170），各亞型感染率由高到低依次為 HPV16、58、52、18、53。以HPV16單一感染為主共108例，占單一感染總數(shù)的63.23%（108/156），其次為 HPV58共21例，占單一感染總數(shù)的13.46%（21/156）。多重感染為14例，占宮頸癌患者的7.73%（14/181），占 HPV陽(yáng)性宮頸癌患者的8.24%（14/170）。以二重感染為主，共13例（92.86%，13/14），均為 HPV16的合并感染，即 HPV 16＋58、16＋53、16＋39、16＋18、16＋45、16＋52、16＋66、16＋6，其中以 HPV16＋58最為常見（4/13），其次為 HPV 16＋53/16＋39各2例（，2/13）。三重感染1例（1/14），為 HPV 33＋59＋66，均為高危亞型，未見HPV16合并感染。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病具有經(jīng)濟(jì)、地理、人群及種族等分布特點(diǎn)，世界癌癥組織的多中心研究提示［3－4］，不同國(guó)家不同地區(qū)HPV感染率不同，但是與宮頸癌的分布相一致。Das等［5］發(fā)現(xiàn)印度婦女宮頸癌中HPV－DNA檢出率高達(dá)98%，我國(guó)海南地區(qū)宮頸癌患者中HPV感染率為94%［6］，本研究中宮頸癌患者HPV感染率為93.92%，與其他地區(qū)的報(bào)道基本一致。不同的地區(qū)流行的基因型有所不同，全球HPV感染率為10.4%、非洲22.1%、亞洲8.0%、歐洲 8.1%［7］。西 藏 地 區(qū) 9.19%［8］、青 海 地 區(qū)16.72%［9］、高 原 地 區(qū) 藏 族 19.50%［10］，北 京 地 區(qū)57.1%［11］。各地差異很大，總體上欠發(fā)達(dá)地區(qū)宮頸癌發(fā)病率高于較發(fā)達(dá)地區(qū)；地理位置而言，宮頸癌發(fā)病率農(nóng)村比城市高、山區(qū)比平原高、內(nèi)地比沿海高［12］；種族而言，世界范圍內(nèi)非洲裔美國(guó)人、拉丁美洲人、美洲印第安人的宮頸癌發(fā)病率較高［13］。

HPV在人群和宮頸癌患者中的分布呈現(xiàn)明顯的地域特征，不同亞型HPV感染致癌性及其后果不同。世界范圍內(nèi)共同的最常見的亞型為HPV16和18，HPV16在所有HPV陽(yáng)性的宮頸癌患者中的平均感染率為57.4%［14］。古扎麗努爾.阿不力孜等［15］報(bào)道的新疆維吾爾族宮頸癌 HPV16感染占94.31%，是目前發(fā)現(xiàn)HPV16感染率最高的地區(qū)。同樣在不同的地區(qū)，除了HPV16，宮頸癌中 HPV其他型別的比例會(huì)有些差異，按照地區(qū)分類前5位分別為：非洲 HPV16、18、33、45、35；亞洲 HPV16、18、58、33、52；歐洲 HPV16、18、33、31、45［7］。2007年一項(xiàng)橫跨我國(guó)7個(gè)宮頸癌發(fā)病率不同地區(qū)的19家醫(yī)院開展的多中心研究結(jié)果顯示［7］，在宮頸癌患者中最常發(fā)現(xiàn)的 HPV DNA類型是 HPV16、18、31、52、58。本地區(qū)藏族婦女HPV常見亞型依次為HPV16、58、52、53、18［10］，本研究中宮頸癌 HPV 常見亞型為 HPV16、58、52、18、53，分布相似，有民族和地域的分布特點(diǎn)。HPV16出現(xiàn)的頻率最高，排在第2位的 HPV58占14.71%，其頻率明顯低于HPV16，與上述多個(gè)地區(qū)的研究結(jié)果不同。HPV52排在第3位，作為西方國(guó)家主要型別的HPV18相對(duì)少見，排在第4位，之后是HPV53，在青海地區(qū)和高原藏族婦女常見亞型中亦排名第4，HPV53可能是本地區(qū)和藏族相對(duì)其他地區(qū)和民族的優(yōu)勢(shì)型別。

HPV持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的直接病因，而HPV多重感染是否促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生一直是學(xué)者們關(guān)注的問題。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，多重感染并不增加宮頸癌的發(fā)生。大量研究提議持續(xù)感染同一種HPV高危型可能會(huì)加快個(gè)體的病變，但HPV高危型多重感染在宮頸病變的進(jìn)展中是否起重要作用尚不明確［16］。文獻(xiàn)報(bào)道 HPV的多重感染率從17.5%至58.9%不等［17］。在國(guó)際癌癥研究組織（IARC）所進(jìn)行的研究中，病例組多重感染為8.1%，對(duì)照組13.9%，對(duì)照組多重感染率較高，認(rèn)為多重感染與宮頸病變的級(jí)別無關(guān)，多重感染并不增加宮頸癌的發(fā)生［18］。本研究結(jié)果也顯示，藏族宮頸癌以單一高危型HPV感染為主，多重感染占7.73%。

青海高原地處青藏高原東北部，海拔大多在4000m以上。藏族人口集中在高寒、缺氧、經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生條件落后、交通不便的6個(gè)藏族自治州，以游牧生活為主。單一的飲食結(jié)構(gòu)、家庭式分娩，感染各種病原體的機(jī)會(huì)多、就診機(jī)會(huì)少?；缄幍姥住m頸炎及宮頸糜爛不能及早得到診治，從而增加了HPV感染的機(jī)會(huì)，使得藏族婦女患宮頸癌的幾率也隨之增加。宮頸癌是感染性疾病，預(yù)防HPV感染可以預(yù)防宮頸癌。發(fā)展農(nóng)牧區(qū)經(jīng)濟(jì)，改善交通和居住條件，加大對(duì)基層的醫(yī)療投入，增強(qiáng)衛(wèi)生保健知識(shí)的普及，提高婦女的衛(wèi)生要求，加大對(duì)各種生殖道疾病的防治力度，同時(shí)對(duì)農(nóng)牧區(qū)婦女進(jìn)行定期的宮頸癌普查，以降低高原地區(qū)藏族婦女宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。

［1］Schiffman M，Kjaer SK.Chapter 2：Natural History of Anogenital Human Papillomavirus Infection andNeoplasia［J］.J Natl Cancer Inst Monogr，2003，31：9－14.

［2］Shi JF，Qiao Yl，Smith JS，et al.Epidemiology and prevention of human papillomavirus and cervical cancer in China and Mongolia［J］.Vaecine，2008，26（Suppl 12）：53－59.

［3］Kin CJ，Jeong JK，Park M，et al.HPV oligonucleotide microarray－based detection of HPV genotypes in cervical neoplasticlestions［J］.Gynecol Oncol，2003，89（2）：210－217.

［4］Nagpal JK，Sahai S，Das BR.P53codon 72polymorphism and susceptibility to development of human papilloma virus 2associated cervical cancer in Indian women［J］.Eur J Clin lnvest，2002，32（12）：943－948.

［5］Das BC，Sharma JK，Gopalkrishna V，et al.A high frequency of human papillomavirus DNA sequences in cervical carcinomas of lndian women as revealed by Southern blot hybridization and polymerase chain reaction［J］.J Med Virol，1992，36：239－245.

［6］賀國(guó)麗，吳秀榮，楊舒盈，等.海南地區(qū)宮頸癌的HPV基因型檢測(cè)及其臨床意義［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2009，25（7）：407－409.

［7］趙方輝，喬友林.人乳頭瘤病毒感染分子流行病學(xué)研究［J］.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2010，26（5）：327－330.

［8］靳瓊，沈鏗，李輝，等.西藏自治區(qū)婦女子宮頸人乳頭狀瘤病毒感染現(xiàn)狀調(diào)查及相關(guān)因素分析［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44（12）：899.

［9］才仁卓瑪，張建青，魏春梅.青海省26622名臨床就診婦女宮頸人乳頭瘤病毒感染情況及亞型分布［J］.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2013，21（12）：812－816.

［10］才仁卓瑪，張建青，魏春梅，等.高原地區(qū)藏族婦女宮頸人乳頭瘤病毒感染各亞型分布狀況調(diào)查［J］.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2014，22（6）：399－402.

［11］楊英捷，趙健，李雪倩，等.2 285例女性下生殖道人乳頭瘤病毒感染篩查結(jié)果分析［J］.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2006，22（6）：444－445.

［12］馬丁，奚玲.宮頸癌流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2001，17（2）：61.

［13］Franco，Eduardo L，Duarte F，et al.Cervical cancer：epidemiology，prevention and the role of human papillomavirus infection［J］.Canadian Medical Association Journal，2001，l64（7）：1017－1025.

［14］Agnantis NJ，Sotiriadis A，Paraskevaidis E.111ecurrent status of HPV DNA testing［J］.European Journal of Gynaecological Oncology，2003，24（5）：351－356.

［15］古扎麗努爾·阿不力孜，程靜新，米克熱木，等.新疆維吾爾族婦女宮頸癌的 HPV譜研究［J］.腫瘤，2007，27（5）：379－382.

［16］An HJ，Cho NH，Lee SY，et al.Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papilliomavirus（HPV）genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method［J］.Cancer，2003，97（7）：1672－1680.

［17］Peyton CL，Gravitt PE，Hunt WC，et al.Determinants of genital human papillomavirus detection in a US population［J］.J Infect Dis，2001，183：1554－1564.

［18］Levi J E，Kleter B，Quint WG，et al.High prevalence of human papillomavirus（HPV）infections and high frepuency of multiple HPV genotypes in human immunodeficiency virusinfected women in Brazil［J］.J Clin Microbiol，2002，40（9）：3341－3345.