郭小明， 趙文君， 白人驍， 邢國勝*

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津300073;2.天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所，天津300211)

軟骨缺損后，由于其缺乏神經(jīng)血管營養(yǎng)的供應(yīng)，難以自身修復。組織工程軟骨的構(gòu)建為軟骨缺損的修復開辟了一條新的途徑。羊膜是一種重要的細胞支架［1-2］，可以為細胞生長輸送營養(yǎng)及排泄代謝產(chǎn)物的三維多孔結(jié)構(gòu)的細胞載體，其有很好的生物相容性，不表達白細胞抗原，排斥反應(yīng)低，含有膠原、糖蛋白并且可以表達多種生長因子及其mRNA的相關(guān)蛋白。目前限制組織工程軟骨進展的是種子細胞問題，最理想的種子細胞是自體軟骨細胞。研究報道要形成組織工程軟骨起始接種的軟骨細胞密度要達到107個/mL，然而軟骨細胞傳代3次后會出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，失去表型，要達到起始接種濃度將要消化大塊的軟骨組織塊，這將會對身體造成新的損害，過高的起始接種濃度限制了組織工程軟骨臨床的應(yīng)用。前期實驗研究10-9、10-8、10-7mol/L濃度的大豆異黃酮對體外軟骨細胞的增殖與分化有促進作用［3］，大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞的增殖與分化是否有促進作用，本實驗研究這三種濃度的大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上的軟骨細胞增殖與分化的影響，為解決起始接種濃度奠定基礎(chǔ)，為將其應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡兔子由天津醫(yī)院動物室提供，無菌胎盤由天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院惠贈;Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司，批號C6885);胰蛋白酶 (天津市灝洋生物制品有限責任公司，批號9AC10360);DMEM/F-12培養(yǎng)基 (美國 Gibco公司，批號15200096);MTT(美 國 Sigma公 司，批 號9BT10330);大豆異黃酮 (華北制藥股份有限公司，批號20110104);二甲基亞砜 (分析純，上海生工生物工程有限公司，批號081228);亞甲藍注射液 (江蘇濟川制藥有限公司);甲苯胺藍 (中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司);Trizol(美國invitrogen公司，批號1373343);三氯甲烷 (天津市恒昊科工貿(mào)有限公司，批號200000816);異丙醇 (天津市化學試劑二廠);無水乙醇 (天津市方得科技有限公司，批號20080722);SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，BKA805);PrimScript RT reagent Kit(TaKaRa，DRR037A);DEPC(BD Science，批 號D-5758);酶標儀 (美國Dynex);倒置顯微鏡 (日本Olympus公司);96孔、24孔、6孔細胞培養(yǎng)板(美國 Costar公司);細胞培養(yǎng)瓶 (美國 Costar公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (英國RS Bitech公司)。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞的分離及傳代培養(yǎng) 參考文獻［4］方法加以改進。取健康4周齡幼兔，處死后在無菌條件下取雙上、下肢關(guān)節(jié)的軟骨，Hank’s液沖洗。剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶消化，終止消化后，取消化液于1 500 r/min離心8 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液中重懸細胞，接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。待培養(yǎng)瓶底單層軟骨細胞達80%時進行傳代。

1.2.2 軟骨細胞的組織化學染色鑒定 參考Terry等［5］、Green［6］方法加以改進。吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，10%中性福爾馬林中固定過夜，70%乙醇固定20 min。用0.04%甲苯胺藍染色20 min，迅速用無水乙醇漂洗1次，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 脫細胞羊膜的制備 參考文獻 ［7］方法加以改進。取無菌胎盤鈍性分離羊膜后，用PBS液反復沖洗，去除表面的雜質(zhì)。將羊膜放于同體積0.25%胰蛋白酶和0.12%EDTA的消化液中消化4 h，用PBS液沖洗3遍，無菌棉簽擦去羊膜表面殘留的細胞。任取一小塊羊膜平鋪于載玻片上，滴加亞甲藍染液，5 min后倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 脫細胞羊膜負載軟骨細胞 將羊膜分割為(1×1)cm2大小，將其置于無菌載玻片上，將邊緣折于載玻片背側(cè)，分別置于24孔、6孔細胞培養(yǎng)板中。取體外培養(yǎng)的第三代軟骨細胞接種其上。

1.2.5 大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞增殖的影響 取脫細胞羊膜負載第三代軟骨細胞的24孔板，實驗組分別加入含有10-7、10-8、10-9mol/L濃度的大豆異黃酮DMEM/F-12培養(yǎng)液，對照組給予 DMEM/F-12培養(yǎng)液。接種2、3、4、5、6 d分別于同一時間每孔加入5 g/L的MTT 60 μL，繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，加入 DMSO 600 μL/孔，震蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，將每孔的上清液移至96孔板中，立即用酶標儀在570 nm波長處測定。

1.2.6 大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞胰島素樣生子因子 (IGF-1)mRNA表達的影響 取脫細胞羊膜負載第三代軟骨細胞的6孔板，實驗組分別加入含有10-7、10-8、10-9mol/L濃度的大豆異黃酮DMEM/F-12培養(yǎng)液，對照組給予DMEM/F-12培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 d后，分別加入1 mL Trizol，按試劑盒步驟進行RNA提取。應(yīng)用軟件OIigo 6，根據(jù)GenBank所發(fā)布的IGF-1、β-actin基因序列進行設(shè)計，IGF-1序列為上游5’-GGTGGATGCTCTTCAGTTCG-3’，下游 3’-CTCCAGCCTCCTCAGATCAC-5’產(chǎn)物大小為136 bp。逆轉(zhuǎn)錄:參照文獻 ［8］，在0.5 mL無RNA酶的離心管中依次加入 5 ×RT Buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μL，寡聚胸腺嘧啶引物 ［Oligo(dT)］1 μL，隨機引物(100 μmol/L)1 μL，總 RNA 2 μg，加焦碳酸二乙酯水，補足至20 μL。移液器吹打混勻，順時離心3 s，37℃，15 min，85℃5 s后于-20℃保存。按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書用Real-time PCR進行定量檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析 (LSD)。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，P＞0.05差異無統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細胞的生長情況 倒置顯微鏡下觀察顯示，原代分離的軟骨細胞貼壁后，細胞呈三角形或梭形，培養(yǎng)5 d后，細胞已融和成片，呈典型的“鋪路石”狀 (圖1)。

圖1 原代軟骨細胞的形態(tài) (倒置顯微鏡，×200)Fig.1 Morphologry of primary culture chondrocytes(inverted microscope， ×200)

2.2 脫細胞羊膜的觀察 倒置顯微鏡下觀察，未做脫細胞處理的羊膜亞甲藍染色見羊膜上大量深藍色的異染顆粒 (圖2)，羊膜經(jīng)脫細胞處理后無深藍色異染顆粒 (圖3)。

2.3 脫細胞羊膜與軟骨細胞的復合 倒置顯微鏡下觀察，未負載軟骨細胞的羊膜，其表面高低不平(圖4)，與軟骨細胞復合后1 d，可見軟骨細胞生存狀態(tài)良好，部分軟骨細胞伸出偽足 (圖5)。甲苯胺藍染色結(jié)果顯示:軟骨細胞基質(zhì)呈藍染色，細胞核呈深藍色，細胞呈三角形，圓形或梭形(圖6)。

圖2 未脫細胞的羊膜 (亞甲藍染色，倒置顯微鏡，×100)Fig.2 Untreated amniotic(stained by methylene blue，inverted microscope， ×100)

圖3 脫細胞羊膜亞甲藍染色 (亞甲藍染色，倒置顯微鏡，×100)Fig.3 Treated amniotic(stained by methylene blue，inverted microscope， ×100)

2.4 大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞增殖的影響 培養(yǎng)第2天時，10-9、10-8、10-7mol/L組軟骨細胞的增殖與對照組軟骨細胞增殖基本一樣 (P＞0.05)，第3天時，只有10-7mol/L組軟骨細胞的增殖高于對照組 (P＜0.05)，從第4天開始，10-9、10-8、10-7mol/L組軟骨細胞的增殖均高于對照組 (P＜0.05)。10-7mol/L組對軟骨細胞的增殖效果更加明顯 (見表1)。

2.5 不同濃度大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞IGF-1 mRNA表達的影響 以對照組為標準，10-9、10-8、10-7mol/L組 IGF-1 mRNA的相對表達量均高于對照組，并且具有劑量依賴性，10-7mol/L組最明顯 (表2)。

圖4 未復合軟骨細胞的脫細胞羊膜 (倒置顯微鏡，×200)Fig.4 Cell-free amniotic membrance without chondrocytes(inverted microscope， ×200)

圖5 軟骨細胞與脫細胞羊膜復合，部分伸出偽足 (倒置顯微鏡，×200)Fig.5 Some chondrocytes adhere in the decellularized amniotic membrance streched out pseudopodium(inverted microscope， ×200)

表1 大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞增殖的影響 (±s，n=5)Tab.1 Effect of soy isoflavones with various concentrations on the chondrocyte proliferation detected(±s，n=5)

表1 大豆異黃酮對負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞增殖的影響 (±s，n=5)Tab.1 Effect of soy isoflavones with various concentrations on the chondrocyte proliferation detected(±s，n=5)

注:與對照組比較，*P＜0.05

0.036 0.216±0.016 10-9mol/L大豆異黃酮組 0.118±0.010 0.130±0.032 0.182±0.009* 0.248±0.021* 0.279±0.026*10-8mol/L大豆異黃酮組 0.121±0.011 0.134±0.026 0.188±0.011* 0.248±0.014* 0.289±0.036*10-7mol/L大豆異黃酮組 0.125±0.013 0.154±0.021* 0.227±0.016* 0.295±0.016* 0.335±0.031 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d對照組 0.114±0.009 0.126±0.013 0.159±0.008 0.192±組別 培養(yǎng)天數(shù)*

圖6 負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞 (甲苯胺藍染色，倒置顯微鏡，×200)Fig.6 Chondrocytes cultured on the decellularized amniotic membrance(stained by toluidine blue，inverted microscope， ×200)

表2 不同濃度大豆異黃酮作用下IGF-1 mRNA的相對表達量Tab.2 Relative transcript level of IGF-1 under soy isoflavones with various concentrations

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接的血液供應(yīng)、淋巴細胞和神經(jīng)支配，并且生理代謝有一定的特點，受損后很難自身修復。目前國內(nèi)外對軟骨損傷的修復研究主要集中在關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)、軟骨細胞移植術(shù)、軟骨鉆孔術(shù)、組織化工程軟骨，其中關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)對早期關(guān)節(jié)炎療效顯著，但是遠期療效有待進一步證實，軟骨細胞移植對大面積的軟骨缺損顯得無能為力，軟骨下鉆孔術(shù)其形成的修復組織復雜，且耐磨性較差，組織工程化軟骨被認為最有應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)軟骨修復材料。目前組織化工程軟骨修復軟骨缺損的實驗研究已取得了一定的成果，但是臨床應(yīng)用卻是很少，限制其臨床應(yīng)用的主要問題是種子細胞問題，種子細胞的來源主要有軟骨細胞，骨髓間充質(zhì)細胞，其中最理想的種子細胞是自體軟骨細胞。Puelacher等［9］將軟骨細胞接種到支架上再將其植入裸鼠的皮下組織，發(fā)現(xiàn)當密度低于1×107個/mL時在皮下很少有軟骨組織形成。張瑛等［10］將不同濃度的軟骨細胞接種到PLGA支架上發(fā)現(xiàn)，體外形成兔軟骨組織的適宜細胞接種密度為4×107個/mL，這兩個實驗的研究結(jié)果都說明，要形成組織工程軟骨將需要大量的軟骨細胞，然而軟骨細胞在體外傳到第四代時就會發(fā)生去分化現(xiàn)象，因此獲得大量的軟骨細胞，必然需要大塊的軟骨組織，大量的軟骨塊將會對身體產(chǎn)生新的損傷。本實驗研究顯示，10-7mol/L濃度的大豆異黃酮仍可明顯促進負載于羊膜上軟骨細胞的增殖，這預(yù)示著，接種軟骨細胞時，可以降低起始接種的濃度，這樣可以減少軟骨組織的消耗，使得組織工程軟骨的臨床應(yīng)用更近一步。但是減少起始接種濃度后促進負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞的增殖，是否與高濃度接種形成的軟骨組織一樣，還需進一步的研究。

IGF-1是人體內(nèi)一種重要的細胞因子，可以通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌方式與細胞膜上的特異性受體結(jié)合，對軟骨細胞的生長發(fā)育有重要的作用［11］。研究證實，IGF-1在10 g/L時，可明顯促進軟骨細胞的增殖，達到50 g/L時，增殖活躍性達到最高［12］，還可以促進軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖，維持軟骨細胞的表型［13-14］。并且還可通過組織軟骨基質(zhì)中金屬蛋白酶的表達，起到抑制蛋白多糖退變的作用［15-16］。本實驗研究顯示，不同濃度的大豆異黃酮均可促進負載于脫細胞羊膜上軟骨細胞分泌IGF-1，分泌的IGF-1不僅可以促進軟骨細胞的增殖，并且還可維持軟骨細胞表型，這樣使得形成的組織工程軟骨的質(zhì)量更好，為臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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