郭小明， 趙文君， 白人驍， 邢國勝*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300073;2.天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所，天津300211)

軟骨缺損后，由于其缺乏神經(jīng)血管營養(yǎng)的供應(yīng)，難以自身修復(fù)。組織工程軟骨的構(gòu)建為軟骨缺損的修復(fù)開辟了一條新的途徑。羊膜是一種重要的細(xì)胞支架［1-2］，可以為細(xì)胞生長輸送營養(yǎng)及排泄代謝產(chǎn)物的三維多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞載體，其有很好的生物相容性，不表達(dá)白細(xì)胞抗原，排斥反應(yīng)低，含有膠原、糖蛋白并且可以表達(dá)多種生長因子及其mRNA的相關(guān)蛋白。目前限制組織工程軟骨進(jìn)展的是種子細(xì)胞問題，最理想的種子細(xì)胞是自體軟骨細(xì)胞。研究報道要形成組織工程軟骨起始接種的軟骨細(xì)胞密度要達(dá)到107個/mL，然而軟骨細(xì)胞傳代3次后會出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，失去表型，要達(dá)到起始接種濃度將要消化大塊的軟骨組織塊，這將會對身體造成新的損害，過高的起始接種濃度限制了組織工程軟骨臨床的應(yīng)用。前期實驗研究10-9、10-8、10-7mol/L濃度的大豆異黃酮對體外軟骨細(xì)胞的增殖與分化有促進(jìn)作用［3］，大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的增殖與分化是否有促進(jìn)作用，本實驗研究這三種濃度的大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上的軟骨細(xì)胞增殖與分化的影響，為解決起始接種濃度奠定基礎(chǔ)，為將其應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡兔子由天津醫(yī)院動物室提供，無菌胎盤由天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院惠贈;Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司，批號C6885);胰蛋白酶 (天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司，批號9AC10360);DMEM/F-12培養(yǎng)基 (美國 Gibco公司，批號15200096);MTT(美 國 Sigma公 司，批 號9BT10330);大豆異黃酮 (華北制藥股份有限公司，批號20110104);二甲基亞砜 (分析純，上海生工生物工程有限公司，批號081228);亞甲藍(lán)注射液 (江蘇濟(jì)川制藥有限公司);甲苯胺藍(lán) (中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);Trizol(美國invitrogen公司，批號1373343);三氯甲烷 (天津市恒昊科工貿(mào)有限公司，批號200000816);異丙醇 (天津市化學(xué)試劑二廠);無水乙醇 (天津市方得科技有限公司，批號20080722);SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，BKA805);PrimScript RT reagent Kit(TaKaRa，DRR037A);DEPC(BD Science，批 號D-5758);酶標(biāo)儀 (美國Dynex);倒置顯微鏡 (日本Olympus公司);96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國 Costar公司);細(xì)胞培養(yǎng)瓶 (美國 Costar公司);二氧化碳培養(yǎng)箱 (英國RS Bitech公司)。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［4］方法加以改進(jìn)。取健康4周齡幼兔，處死后在無菌條件下取雙上、下肢關(guān)節(jié)的軟骨，Hank’s液沖洗。剪碎至1 mm3大小，依次用0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶消化，終止消化后，取消化液于1 500 r/min離心8 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞，接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。待培養(yǎng)瓶底單層軟骨細(xì)胞達(dá)80%時進(jìn)行傳代。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的組織化學(xué)染色鑒定 參考Terry等［5］、Green［6］方法加以改進(jìn)。吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，10%中性福爾馬林中固定過夜，70%乙醇固定20 min。用0.04%甲苯胺藍(lán)染色20 min，迅速用無水乙醇漂洗1次，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3 脫細(xì)胞羊膜的制備 參考文獻(xiàn) ［7］方法加以改進(jìn)。取無菌胎盤鈍性分離羊膜后，用PBS液反復(fù)沖洗，去除表面的雜質(zhì)。將羊膜放于同體積0.25%胰蛋白酶和0.12%EDTA的消化液中消化4 h，用PBS液沖洗3遍，無菌棉簽擦去羊膜表面殘留的細(xì)胞。任取一小塊羊膜平鋪于載玻片上，滴加亞甲藍(lán)染液，5 min后倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4 脫細(xì)胞羊膜負(fù)載軟骨細(xì)胞 將羊膜分割為(1×1)cm2大小，將其置于無菌載玻片上，將邊緣折于載玻片背側(cè)，分別置于24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。取體外培養(yǎng)的第三代軟骨細(xì)胞接種其上。

1.2.5 大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞增殖的影響 取脫細(xì)胞羊膜負(fù)載第三代軟骨細(xì)胞的24孔板，實驗組分別加入含有10-7、10-8、10-9mol/L濃度的大豆異黃酮DMEM/F-12培養(yǎng)液，對照組給予 DMEM/F-12培養(yǎng)液。接種2、3、4、5、6 d分別于同一時間每孔加入5 g/L的MTT 60 μL，繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，加入 DMSO 600 μL/孔，震蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，將每孔的上清液移至96孔板中，立即用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定。

1.2.6 大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞胰島素樣生子因子 (IGF-1)mRNA表達(dá)的影響 取脫細(xì)胞羊膜負(fù)載第三代軟骨細(xì)胞的6孔板，實驗組分別加入含有10-7、10-8、10-9mol/L濃度的大豆異黃酮DMEM/F-12培養(yǎng)液，對照組給予DMEM/F-12培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 d后，分別加入1 mL Trizol，按試劑盒步驟進(jìn)行RNA提取。應(yīng)用軟件OIigo 6，根據(jù)GenBank所發(fā)布的IGF-1、β-actin基因序列進(jìn)行設(shè)計，IGF-1序列為上游5’-GGTGGATGCTCTTCAGTTCG-3’，下游 3’-CTCCAGCCTCCTCAGATCAC-5’產(chǎn)物大小為136 bp。逆轉(zhuǎn)錄:參照文獻(xiàn) ［8］，在0.5 mL無RNA酶的離心管中依次加入 5 ×RT Buffer 4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物 1 μL，寡聚胸腺嘧啶引物 ［Oligo(dT)］1 μL，隨機(jī)引物(100 μmol/L)1 μL，總 RNA 2 μg，加焦碳酸二乙酯水，補(bǔ)足至20 μL。移液器吹打混勻，順時離心3 s，37℃，15 min，85℃5 s后于-20℃保存。按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書用Real-time PCR進(jìn)行定量檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析 (LSD)。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞的生長情況 倒置顯微鏡下觀察顯示，原代分離的軟骨細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞呈三角形或梭形，培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞已融和成片，呈典型的“鋪路石”狀 (圖1)。

圖1 原代軟骨細(xì)胞的形態(tài) (倒置顯微鏡，×200)Fig.1 Morphologry of primary culture chondrocytes(inverted microscope， ×200)

2.2 脫細(xì)胞羊膜的觀察 倒置顯微鏡下觀察，未做脫細(xì)胞處理的羊膜亞甲藍(lán)染色見羊膜上大量深藍(lán)色的異染顆粒 (圖2)，羊膜經(jīng)脫細(xì)胞處理后無深藍(lán)色異染顆粒 (圖3)。

2.3 脫細(xì)胞羊膜與軟骨細(xì)胞的復(fù)合 倒置顯微鏡下觀察，未負(fù)載軟骨細(xì)胞的羊膜，其表面高低不平(圖4)，與軟骨細(xì)胞復(fù)合后1 d，可見軟骨細(xì)胞生存狀態(tài)良好，部分軟骨細(xì)胞伸出偽足 (圖5)。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示:軟骨細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)染色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞呈三角形，圓形或梭形(圖6)。

圖2 未脫細(xì)胞的羊膜 (亞甲藍(lán)染色，倒置顯微鏡，×100)Fig.2 Untreated amniotic(stained by methylene blue，inverted microscope， ×100)

圖3 脫細(xì)胞羊膜亞甲藍(lán)染色 (亞甲藍(lán)染色，倒置顯微鏡，×100)Fig.3 Treated amniotic(stained by methylene blue，inverted microscope， ×100)

2.4 大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)第2天時，10-9、10-8、10-7mol/L組軟骨細(xì)胞的增殖與對照組軟骨細(xì)胞增殖基本一樣 (P＞0.05)，第3天時，只有10-7mol/L組軟骨細(xì)胞的增殖高于對照組 (P＜0.05)，從第4天開始，10-9、10-8、10-7mol/L組軟骨細(xì)胞的增殖均高于對照組 (P＜0.05)。10-7mol/L組對軟骨細(xì)胞的增殖效果更加明顯 (見表1)。

2.5 不同濃度大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞IGF-1 mRNA表達(dá)的影響 以對照組為標(biāo)準(zhǔn)，10-9、10-8、10-7mol/L組 IGF-1 mRNA的相對表達(dá)量均高于對照組，并且具有劑量依賴性，10-7mol/L組最明顯 (表2)。

圖4 未復(fù)合軟骨細(xì)胞的脫細(xì)胞羊膜 (倒置顯微鏡，×200)Fig.4 Cell-free amniotic membrance without chondrocytes(inverted microscope， ×200)

圖5 軟骨細(xì)胞與脫細(xì)胞羊膜復(fù)合，部分伸出偽足 (倒置顯微鏡，×200)Fig.5 Some chondrocytes adhere in the decellularized amniotic membrance streched out pseudopodium(inverted microscope， ×200)

表1 大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=5)Tab.1 Effect of soy isoflavones with various concentrations on the chondrocyte proliferation detected(±s，n=5)

表1 大豆異黃酮對負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=5)Tab.1 Effect of soy isoflavones with various concentrations on the chondrocyte proliferation detected(±s，n=5)

注:與對照組比較，*P＜0.05

0.036 0.216±0.016 10-9mol/L大豆異黃酮組 0.118±0.010 0.130±0.032 0.182±0.009* 0.248±0.021* 0.279±0.026*10-8mol/L大豆異黃酮組 0.121±0.011 0.134±0.026 0.188±0.011* 0.248±0.014* 0.289±0.036*10-7mol/L大豆異黃酮組 0.125±0.013 0.154±0.021* 0.227±0.016* 0.295±0.016* 0.335±0.031 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d對照組 0.114±0.009 0.126±0.013 0.159±0.008 0.192±組別 培養(yǎng)天數(shù)*

圖6 負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞 (甲苯胺藍(lán)染色，倒置顯微鏡，×200)Fig.6 Chondrocytes cultured on the decellularized amniotic membrance(stained by toluidine blue，inverted microscope， ×200)

表2 不同濃度大豆異黃酮作用下IGF-1 mRNA的相對表達(dá)量Tab.2 Relative transcript level of IGF-1 under soy isoflavones with various concentrations

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接的血液供應(yīng)、淋巴細(xì)胞和神經(jīng)支配，并且生理代謝有一定的特點，受損后很難自身修復(fù)。目前國內(nèi)外對軟骨損傷的修復(fù)研究主要集中在關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)、軟骨細(xì)胞移植術(shù)、軟骨鉆孔術(shù)、組織化工程軟骨，其中關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)對早期關(guān)節(jié)炎療效顯著，但是遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步證實，軟骨細(xì)胞移植對大面積的軟骨缺損顯得無能為力，軟骨下鉆孔術(shù)其形成的修復(fù)組織復(fù)雜，且耐磨性較差，組織工程化軟骨被認(rèn)為最有應(yīng)用前景的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料。目前組織化工程軟骨修復(fù)軟骨缺損的實驗研究已取得了一定的成果，但是臨床應(yīng)用卻是很少，限制其臨床應(yīng)用的主要問題是種子細(xì)胞問題，種子細(xì)胞的來源主要有軟骨細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，其中最理想的種子細(xì)胞是自體軟骨細(xì)胞。Puelacher等［9］將軟骨細(xì)胞接種到支架上再將其植入裸鼠的皮下組織，發(fā)現(xiàn)當(dāng)密度低于1×107個/mL時在皮下很少有軟骨組織形成。張瑛等［10］將不同濃度的軟骨細(xì)胞接種到PLGA支架上發(fā)現(xiàn)，體外形成兔軟骨組織的適宜細(xì)胞接種密度為4×107個/mL，這兩個實驗的研究結(jié)果都說明，要形成組織工程軟骨將需要大量的軟骨細(xì)胞，然而軟骨細(xì)胞在體外傳到第四代時就會發(fā)生去分化現(xiàn)象，因此獲得大量的軟骨細(xì)胞，必然需要大塊的軟骨組織，大量的軟骨塊將會對身體產(chǎn)生新的損傷。本實驗研究顯示，10-7mol/L濃度的大豆異黃酮仍可明顯促進(jìn)負(fù)載于羊膜上軟骨細(xì)胞的增殖，這預(yù)示著，接種軟骨細(xì)胞時，可以降低起始接種的濃度，這樣可以減少軟骨組織的消耗，使得組織工程軟骨的臨床應(yīng)用更近一步。但是減少起始接種濃度后促進(jìn)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的增殖，是否與高濃度接種形成的軟骨組織一樣，還需進(jìn)一步的研究。

IGF-1是人體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子，可以通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌方式與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，對軟骨細(xì)胞的生長發(fā)育有重要的作用［11］。研究證實，IGF-1在10 g/L時，可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，達(dá)到50 g/L時，增殖活躍性達(dá)到最高［12］，還可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖，維持軟骨細(xì)胞的表型［13-14］。并且還可通過組織軟骨基質(zhì)中金屬蛋白酶的表達(dá)，起到抑制蛋白多糖退變的作用［15-16］。本實驗研究顯示，不同濃度的大豆異黃酮均可促進(jìn)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞分泌IGF-1，分泌的IGF-1不僅可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，并且還可維持軟骨細(xì)胞表型，這樣使得形成的組織工程軟骨的質(zhì)量更好，為臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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