王 倩，劉好寶

(中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所,青島 266101)

煙草重要基因篇：2. 煙草鉀吸收與轉運相關基因

王 倩，劉好寶

(中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所,青島 266101)

煙草是典型的喜鉀作物。除了作為重要的營養(yǎng)元素發(fā)揮作用外,鉀能明顯增強煙株的抗病蟲、抗逆能力,提高煙葉的燃燒性。同時,鉀還通過調節(jié)細胞中的生化反應影響細胞中的有機酸、氨基酸和糖等化學成分,改善煙葉的品質[1]。因此,鉀含量是衡量煙葉品質的重要指標之一。長期以來,煙草鉀素營養(yǎng)研究主要集中于鉀肥種類與品質關系、鉀肥施用方法及施用量、土壤 pH 對鉀素吸收的影響及土壤供鉀特性等方面,其分子機制研究起步較晚。隨著分子生物學的發(fā)展,煙草鉀營養(yǎng)的遺傳、吸收轉運機制等研究取得了較大進展。開展煙草鉀營養(yǎng)基礎研究,充分挖掘鉀營養(yǎng)高效基因,培育鉀營養(yǎng)高效煙草品種,不僅符合煙草行業(yè)降焦減害的主旨,也為研究其他喜鉀作物的鉀營養(yǎng)機制、改善作物品質、提高鉀肥利用率、緩解我國鉀肥貧瘠的現(xiàn)狀提供科學借鑒,具有重大的生產(chǎn)應用和理論研究意義。

植物對鉀的跨膜吸收機制主要有兩種,即高親和性鉀吸收系統(tǒng)(機制Ⅰ)和低親和性鉀吸收系統(tǒng)(機制Ⅱ)。高親和性鉀吸收是植物在低鉀濃度(0.001～0.2 mM)下的主要吸收途徑,K+多通過鉀轉運體介導的主動運輸逆電化學勢梯度進入細胞,需要消耗能量；低親和性鉀吸收主要在高鉀濃度(1～10 mM)下發(fā)揮作用,K+多通過鉀通道調節(jié)的被動運輸進入細胞,該過程依賴細胞膜電勢[2]。更深入的研究表明植物中的鉀吸收情況要復雜于上述簡單的劃分。K+進入根部細胞后,由鉀通道或鉀轉運體將其運往植物的各個組織[3]。植物對鉀的吸收轉運受到一系列鉀轉運蛋白及調控因子的共同調節(jié)。目前煙草鉀吸收與轉運相關基因的研究主要集中于鉀通道、鉀轉運體和鉀營養(yǎng)相關調控基因三個方面。

1 鉀通道

植物中的鉀通道分為 Shaker 家族鉀通道、TPK 家族鉀通道和 Kir-like 家族鉀通道三類[4]。Shaker 家族是介導植物鉀營養(yǎng)吸收、轉運和細胞鉀離子動態(tài)平衡過程的最為重要的鉀通道蛋白,也是煙草鉀營養(yǎng)中研究最早的轉運蛋白。到目前,煙草中報道的鉀通道共有10個,分別是圓錐煙草的 NpKT1、黃花煙草的NKC1、普通煙草的 NtKC1、NTORK1、NKT1、NKT2、NKT3、NKT4、NKT5 和林煙草的 NKT6。Hashimoto 等(1999)從圓錐煙草(Nicotiana paniculata)中克隆得到第一個 Shaker鉀通道基因 NpKT1,但相關功能研究未見報道。隨后,Sano 等(2007)在對植物細胞周期的研究中,以煙草 BY-2 細胞系為材料,克隆得到四個 Shaker 鉀通道基因 NKT1、NKT2、NtKC1 和 NTORK1[5]。其中,前三個分別與擬南芥 Shaker 鉀通道AKT1、AKT2/3 和 AtKC1 存在同源性,經(jīng)鑒定均具內向整流 Shaker 鉀通道活性；NTORK1 與擬南芥SKOR/GORK 鉀通道亞族同源,均屬于外向整流 Shaker鉀通道。研究發(fā)現(xiàn),NKT1 在 G1 期中表達,調節(jié)細胞的鉀吸收,而 NTORK1 主要在 S 期中表達,調節(jié)細胞的鉀外流,表明鉀通道參與煙草的細胞周期調控[5]。郭兆奎等[6](2008)國內首個報道的鉀通道基因為黃花煙草(Nicotiana rustica)的 NKC1,該基因與馬鈴薯 Shaker鉀通道 SKT1 同源,在煙草幼根、葉片和花等器官均有表達,在幼根中轉錄量最多,缺鉀處理可顯著誘導根系中該基因的轉錄,而高濃度 NH4+處理對該基因的轉錄具有抑制作用。劉好寶等利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術相繼獲得了 4 個鉀通道基因,分別命名為 NKT3[7]、NKT4[8]、NKT5[9]和 NKT6[10]。其中前三個基因均從煙草鉀高效基因型 Special Warne 中獲得,NKT6 從林煙草中獲得。NKT3和 NKT5 與擬南芥 AtKC1 同源[7,9]；NKT4 與擬南芥 AKT1、番茄 LKT1 和馬鈴薯 SKT1 的氨基酸序列相似性分別為 71%、90%和 90%,主要在煙草根部尤其是幼嫩側根中表達,在低鉀和干旱處理早期,該基因的轉錄水平迅速上調,推測該基因在低鉀和干旱等脅迫條件下發(fā)揮重要作用[8],可能與黃花煙草 NKC1 是同工蛋白。NKT6 屬于 Shaker家族 Group II,在林煙草的莖和腋芽中最高,在萼片、葉、花中次之,在根中最低,蛋白主要定位于細胞膜和核膜附近的內質網(wǎng)。干旱與外源 ABA 脅迫處理下該基因的表達量均呈下降趨勢,推測可能參與林煙草的氣孔運動調節(jié)過程[10]。

煙草 TPK 家族基因研究尚處于起步階段,目前只報道了兩個 TPK 家族鉀通道基因——NtTPK1 和NtTPK2。對 NtTPK1 的研究多集中于體外電生理功能上:該基因在普通煙草栽培種 Nicotiana tabacum cv. SR1 中存在 4 個異構體；同 TPK 家族其他蛋白一樣,該蛋白定位與液泡膜,對 K+有極強的選擇性,部分異構體在鹽脅迫和高滲透壓的脅迫誘導后表達量提高[11]。NtTPK2 來源于普通煙草紅花大金元,在花、葉、莖和根中均有表達。兩類基因在煙草鉀生理代謝過程中的作用尚待解析[12]。

2 鉀轉運體

鉀 轉 運 體 分 為 KUP/HAK/KT 轉 運 體 、HKT/TrK 轉 運 體 、 CHX 轉 運 體 和 KEA 轉 運 體 四 類[13]。KUP/HAK/KT 家族是生物界內發(fā)現(xiàn)最早、數(shù)目最多、功能最豐富的鉀轉運體家族,在煙草中也開展了一定的研究。

目前發(fā)現(xiàn)的首個煙草鉀轉運體基因是 NrHAK1,由郭兆奎等[14](2009)從黃花煙草中克隆得到。該基因可恢復酵母鉀吸收缺陷型菌株的吸鉀能力,且在煙苗幼根轉錄水平最高,表明其與煙草根部的鉀吸收有關。隨后,魯黎明等[15](2011)在普通煙草中得到 NrHAK1 的同源基因 NtHAK1,該基因在煙草栽培種 K326中過表達后,轉化株的鉀含量顯著高于野生型,表明其可提高煙株富集鉀的能力[16]。隨著測序技術的發(fā)展和部分煙草基因組數(shù)據(jù)庫信息的公開,利用生物信息學方法預測和獲得基因成為一種新手段。煙草NtPOT10 是利用該策略獲得的 KUP/HAK/KT 家族的成員之一(該基因原來被稱為 TPK1,序列分析表明該基因與擬南芥的 AtPOT10 和水稻的 HAK12 同源,為避免與文中上述的 TPK 鉀通道家族混淆,稱之為NtPOT10)。該基因主要在葉、莖和花中表達,在根中幾乎無表達,其具體功能還有待確定[17]。宋毓峰等(2014,待發(fā)表)通過生物信息學預測,對林煙草和絨毛狀煙草的基因組進行分析,獲得了兩物種KUP/HAK/KT 家族所有的鉀轉運體成員,并對林煙草中一個新基因 HAK11 進行了表達、定位等研究。分析表明,林煙草和絨毛狀煙草均含有 19 個可能的 KUP/HAK/KT 鉀轉運體,HAK11 基因在盛花期林煙草的各組織中均有表達,在主根中表達量最高,側根次之,葉片中的表達量最低,蛋白定位于質膜,脅迫處理后的轉錄水平變化表明其可能參與葉片響應低溫、高溫和低鉀脅迫的應對機制。

3 鉀營養(yǎng)相關調控蛋白

植物的鉀吸收轉運是一個復雜的基因表達網(wǎng)絡調控過程,除鉀通道和鉀轉運體的參與外,還涉及眾多的調控基因[3]。就目前的研究而言,煙草中還未直接鑒定得到新的調控蛋白,大量工作多以煙草為材料,研究其他物種來源的基因在鉀營養(yǎng)過程中的作用。因此,發(fā)現(xiàn)和鑒定煙草自身的鉀營養(yǎng)相關調控基因,解析其調控機制,逐步建立相關調控手段,是了解煙草鉀吸收積累過程、改善煙草鉀素含量的重要內容。

研究表明,植物利用不同的鈣調神經(jīng)素 B 亞基蛋白 CBL(calcineurin B-like protein),與其下游的靶激酶 CIPK(CBL-interacting protein kinase)組成的 CBL-CIPK 信號轉導途徑,將感應到的信號層層傳遞,激活或抑制某些基因的表達水平或蛋白活性,使植物在分子水平上做出相應的反應,從而響應高鹽、低鉀、低溫、干旱等非生物逆境脅迫[18-19]。擬南芥通過 CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1 路徑響應其低鉀脅迫,該路徑也存在于楊樹等植物中[20]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥 AtCIPK23 轉入煙草后,轉基因材料的干物質積累以及各器官鉀含量明顯高于對照,且具有較強的根系活力[21],預示著煙草中極可能也存在類似的機制。

普通煙草 Nt-SYR1 基因編碼一個質膜融合 Qa-SNARE 蛋白。Nt-SYR1 通過其 C 端的跨膜結構域錨定于質膜上。該蛋白被突變或抑制后,K+和 Cl+通道對 ABA 的響應也受到抑制,氣孔關閉受阻,表明 Nt-SYR1可影響包括鉀通道在內的一些離子通道的功能[22]。擬南芥無機焦磷酸酶基因(H+-PPase) AVP2 在煙草中過表達后,NtHAK1 的轉錄水平顯著上調,同時 NKT1 的轉錄水平也略有增加,煙葉 K+的含量顯著增加。該研究表明,鉀轉運體和鉀通道基因的轉錄和表達與液泡膜上 H+-PPase 的能力供應有關[23]。披堿草(Elymus dahuricus)中的氫離子焦磷酸化酶基因 EdHP1 轉入煙草后,煙草的根系活力、總根體積、總表面積及發(fā)育程度等各項指標均明顯優(yōu)于野生型對照,而鉀外排速率卻顯著低于對照,表明 EdHP1 能夠增加植物對鉀的吸收[24]。

4 問題與展望

長期以來,通過傳統(tǒng)的栽培手段和措施來提高煙葉含鉀量及品質的研究均未達到理想效果。煙草鉀營養(yǎng)分子機制研究起步晚而導致理論基礎相對缺乏這一現(xiàn)狀更加劇了國內煙葉與國際優(yōu)質煙葉品質的差異。煙草鉀營養(yǎng)研究成為農(nóng)業(yè)科技的重要關注點之一。隨著其他作物鉀營養(yǎng)研究的深入,開展基礎理論研究、選育鉀營養(yǎng)高效品種以提高煙草自身的鉀營養(yǎng)效率這一策略逐漸受到煙草工作者的廣泛認可。隨著基因組計劃的順利實施,立足于已有的材料資源和數(shù)據(jù)資源,充分借鑒其他作物的研究思路,大力挖掘鉀營養(yǎng)高效的基因,解析其功能及調控路徑,培育鉀營養(yǎng)高效的煙草品種,將成為改善我國煙葉質量的重要手段。

[1]閆慧峰,石屹,李乃會,等. 煙草鉀素營養(yǎng)研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報,2013,15(1):123-129.

[2]Epstein E, Rains D, Elzam O. Resolution of dual mechanisms of potassium absorption by barley roots[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1963, 49(5)∶ 684-692.

[3]Véry A A, Sentenac H. Molecular mechanisms and regulation of K+transport in higher plants[J]. Annu Rev Plant Biol, 2003, 54(1)∶ 575-603.

[4]Lebaudy A, Véry A A, Sentenac H. K+channel activity in plants∶ Genes, regulations and functions[J]. FEBS Lett, 2007, 581(12)∶ 2357-2366.

[5]Sano T, Becker D, Ivashikina N, et al. Plant cells must pass a K+threshold to re-enter the cell cycle[J]. Plant J., 2007, 50(3)∶401-413.

[6]郭兆奎,楊謙,顏培強,等. 黃花煙草 K+通道基因 NKC1 克隆與序列分析[J]. 中國煙草學報,2008,14(5):63-68.

[7]Liu H, Qu P, Liu G, et al. Cloning and expression analysis of potassium channel gene NKT3 from Nicotiana tabacum[J]. Afr J Biotechnol, 2012, 11(48)∶ 10824-10830.

[8]曲平治,劉貫山,劉好寶,等. 普通煙草 K+通道基因 NKT4 的克隆、序列和表達分析[J]. 植物遺傳資源學報,2009,10 (3):354-359.

[9]司叢叢,劉貫山,劉好寶,等. 煙草鉀離子通道基因 NKT5 的克隆和序列分析[J]. 中國煙草科學,2010,31(4):8-13.

[10]靳義榮,宋毓峰,白巖,等. 林煙草鉀離子通道 NKT6 的克隆與表達定位分析[J]. 作物學報,2013,39(9):1602-1611.

[11]Hamamoto S, Marui J, Matsuoka K, et al. Characterization of a tobacco TPK-type K+channel as a novel tonoplast K+channel using yeast tonoplasts[J]. J Biol Chem, 2008, 283(4)∶ 1911-1920.

[12]閆亞飛,王根洪,程廷才,等. 煙草鉀離子通道基因 NtTPK2 的克隆及序列分析[J/OL]. 北京:中國科技論文在線,2012. http∶//www.paper.edu.cn.

[13]M?ser P, Thomine S, Schroeder J I, et al. Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2001, 126(4)∶ 1646-1667.

[14]Guo Z, Yang Q, Wan X, et al. Functional characterization of a potassium transporter gene NrHAK1 in Nicotiana rustica[J]. J Zhejiang Univ-SC B, 2009, 9(12)∶ 944-952.

[15]魯黎明,楊鐵釗. 煙草鉀轉運體基因 NtHAK1 的克隆及表達模式分析[J]. 核農(nóng)學報,2011,25(3):469-476.

[16]譚穎,秦利君,趙丹,等. 共轉化法獲得 HAK1 基因高表達煙草提高植株鉀吸收能力[J]. 植物生理學報,2013,49(7): 689-699.

[17]魯黎明. 煙草鉀轉運體基因 TPK1 的電子克隆及生物信息學分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(1):28-35.

[18]Luan S. The CBL-CIPK network in plant calcium signaling[J]. Trends Plant Sci, 2009, 14(1)∶ 37-42.

[19]Luan S, Lan W, Chul Lee S. Potassium nutrition, sodium toxicity, and calcium signaling∶ connections through the CBL-CIPK network[J]. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12(3)∶ 339-346.

[20]Xu J, Li H, Chen L, et al. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+transporter AKT1 in Arabidopsis[J]. Cell, 2006, 125(7)∶ 1347-1360.

[21]聶紅資,楊鐵釗,楊志曉,等. 不同供鉀水平下轉 AtCIPK23 基因煙草鉀吸收特征的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學,2009(6): 53-56.

[22]Leyman B, Geelen D, Quintero F J, et al. A tobacco syntaxin with a role in hormonal control of guard cell ion channels[J]. Science, 1999, 283(5401)∶ 537-540.

[23]郭兆奎,楊謙,顏培強,等. 擬南芥 AVP2 基因轉化煙草中吸鉀相關基因的轉錄分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2008,36(9):58-64.

[24]金維環(huán),董建輝,陳明,等. 轉 EdHP1(氫離子焦磷酸化酶)基因煙草促進鉀離子吸收的生理機制[J]. 作物學報,2010, 36(10):1752-1759.