鄔 博，張萬江

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)引起的傳染性疾病，其主要傳播途徑是通過氣溶膠方式經(jīng)呼吸道感染機(jī)體引起肺結(jié)核。自MTB發(fā)現(xiàn)至現(xiàn)今，其仍舊是致死率較高的單一致病菌。并且隨著廣泛耐藥和多重耐藥結(jié)核桿菌菌株的出現(xiàn)，以及伴發(fā)有艾滋病患者的增加，致使結(jié)核病的防治工作更加嚴(yán)峻。而目前關(guān)于結(jié)核桿菌的致病機(jī)制還未完全闡明。PhoPR雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system, TCS)作為結(jié)核桿菌感應(yīng)外界環(huán)境變化，并將這些變化信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)菌做出相應(yīng)應(yīng)答調(diào)控的一種系統(tǒng)，其在MTB適應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境變化的調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。隨著對PhoPR TCS認(rèn)識不斷深入，PhoPR TCS在結(jié)核桿菌生理功能、代謝的調(diào)控方面中的重要性和關(guān)鍵性，特別是在細(xì)菌的致病機(jī)制的調(diào)控作用愈來愈受到關(guān)注。

1 PhoPR TCS概述

TCS作為重要的感應(yīng)環(huán)境變化，并作出調(diào)控應(yīng)答的系統(tǒng)，在細(xì)菌感應(yīng)宿主微環(huán)境的變化以及適時(shí)地發(fā)揮調(diào)控應(yīng)答等方面發(fā)揮了重要作用。1986年Ninfa和Magasnik在研究大腸埃希菌氮調(diào)節(jié)蛋白時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了TCS[1]， 隨后研究者在結(jié)核桿菌中發(fā)現(xiàn)了DosS/DosT-DosR、PhoP-PhoR、MprA-MprB、TcrX-TcrY、senX3-regX3、PrrA-PrrB、TrcR-TrcS、MtrA-MtrB等12個完整的TCS。

其中PhoPR TCS作為12個雙組份系統(tǒng)中最基本、最重要的感應(yīng)外界環(huán)境變化，并作出相應(yīng)應(yīng)答的調(diào)控系統(tǒng)，其在結(jié)核桿菌適應(yīng)環(huán)境變化調(diào)控方面有著重要作用。目前對PhoPR TCS的結(jié)構(gòu)功能研究發(fā)現(xiàn)，PhoPR TCS是由兩個基本的元件構(gòu)成，其中PhoR基因編碼的膜結(jié)合的組氨酸激酶感應(yīng)蛋白(Histidine Kinase HK)，是一個保守的蛋白結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)感應(yīng)接收外界環(huán)境變化的各種信號，并將這些信號傳遞給胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(Response Regulator,RR)，而RR是由PhoP基因編碼的，并由兩個區(qū)域組成：N末端接受區(qū)域包含了一個保守的磷酸化位點(diǎn)和幾何結(jié)合域的(α/β)5拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，C末端效應(yīng)區(qū)域包含了一個有翼段的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的DNA結(jié)構(gòu)域[2]。其中N末端的接受域主要負(fù)責(zé)接受來自PhoR蛋白的磷酸化信號；而C末端的效應(yīng)域主要負(fù)責(zé)與所要調(diào)控的靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Pathak[3]等人研究發(fā)現(xiàn)在這兩個功能域之間還存在一個有11個氨基酸殘基長度的連接子，它將PhoP蛋白的兩個功能域連接起來，并且調(diào)控著域間的相互作用。而且這個連接子可通過改變自身構(gòu)象，將N端接受域的磷酸化信號傳遞給C末端的結(jié)合域，促使C末端的DNA結(jié)合域與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用。因此認(rèn)為連接子在域間的相互調(diào)節(jié)中具有重要作用。并且PhoP蛋白域間相互效應(yīng)可能是導(dǎo)致依賴性磷酸化高親和DNA的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)[4]。此外，有研究結(jié)果顯示DNA結(jié)合域能夠結(jié)合到DNA序列的二聚識別串聯(lián)重復(fù)結(jié)合位點(diǎn)上，這個結(jié)合位點(diǎn)位于靶基因的調(diào)節(jié)啟動子的-35區(qū)[5]。Cimino[6]等對PhoP蛋白的C末端DNA結(jié)合域所結(jié)合到的靶基因(msl3，pks2，lipF，fadD21基因)位點(diǎn)序列進(jìn)行了研究，證實(shí)了PhoP蛋白結(jié)合在參與調(diào)控靶基因的上游共有序列上，這個共有序列由兩個直接重復(fù)子DR1，DR2和第3個相關(guān)的重復(fù)子DR3組成。在某些情況下，DR3對于PhoP蛋白結(jié)合到DR1和DR2具有重要作用。并且這個共有序列可被用于篩選全基因組中被PhoPR TCS直接調(diào)節(jié)的相關(guān)基因。而RR的主要功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白，使這些蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，有利于MTB適應(yīng)外界環(huán)境的改變，如低氧、鎂濃度改變以及酸性環(huán)境等。

2 PhoPR TCS與結(jié)核桿菌的毒力

結(jié)核桿菌的毒力因子可根據(jù)其毒力決定簇的功能、分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及細(xì)胞內(nèi)的定位分為以下幾個方面：(1)脂質(zhì)和脂肪酸的代謝產(chǎn)物，包括膽固醇的分解代謝產(chǎn)物；(2)細(xì)胞膜蛋白，包括細(xì)胞壁蛋白、脂蛋白和分泌系統(tǒng)蛋白；(3)抑制巨噬細(xì)胞抗菌效應(yīng)的蛋白，包括參與對活性氧/氮應(yīng)激的反應(yīng)蛋白以及阻止巨噬細(xì)胞吞噬體成熟和抑制細(xì)胞凋亡的蛋白；(4)蛋白激酶；(5)金屬蛋白酶類；(6)輸入、輸出的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；(7)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控子，包括雙組分系統(tǒng)、sigma因子和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子；(8)未知功能蛋白，包括PE和PE-PGRS蛋白家族；(9)其他毒力蛋白[7]。

結(jié)核桿菌的毒力因子在細(xì)菌的致病性上具有重要作用，而PhoPR雙組分系統(tǒng)在細(xì)菌毒力方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8]。RD1作為MTB毒力必需的基因區(qū)域[9]，它存在于致病結(jié)核桿菌復(fù)合群中。其中 PhoPR TCS參與調(diào)節(jié)RD1區(qū)域中的許多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有一些基因是與介導(dǎo)毒力密切相關(guān)的基因。EspB基因位于RD1區(qū)的延伸區(qū)，是由1 383個堿基對構(gòu)成的可以編碼466個氨基酸的基因。其編碼一種分泌型毒力蛋白，該蛋白最先在海分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)，并命名為ESX-1分泌蛋白Mh3881c，通過深入研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在結(jié)核桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度株(H37Rv)中也存在著其同源基因Rv3881c，該基因參與了致病性結(jié)核桿菌ESX-1系統(tǒng)中EspB蛋白的分泌。EspB蛋白在分泌過程中的C末端被裂解為50 kDa和11 kDa兩個蛋白片段，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)EspB蛋白的C末端與ESAT-6具有直接相互作用，并且對保持ESAT-6在細(xì)胞內(nèi)的濃度水平是必需的[10]。研究還發(fā)現(xiàn)在分泌過程中EspB、ESAT-6和CFP-10的分泌是相互依賴的，對結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長具有重要的作用，并且對巨噬細(xì)胞吞噬體的成熟發(fā)揮著抑制作用。在敲除EspB基因的突變菌株中，該菌株的毒力則幾乎喪失[11]，可見EspB在細(xì)菌毒力方面的作用似乎比ESAT-6和CFP-10更顯著。有研究表明，在敲除野生型結(jié)核桿菌菌株的PhoP基因后，細(xì)菌分泌表達(dá)EspB蛋白的量較親本野生型菌株顯著降低[12]。這個結(jié)果表明PhoPR TCS對EspB蛋白表達(dá)可能存在著調(diào)控作用，但是目前關(guān)于PhoPR TCS是否對EspB基因存在直接調(diào)控作用未見報(bào)道，同時(shí)在不同毒力結(jié)核桿菌菌株中EspB蛋白分泌表達(dá)量是否受PhoPR的調(diào)控仍需要進(jìn)一步研究。此外有研究表明，在不同毒力結(jié)核桿菌菌株中，結(jié)核桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)無毒株(H37Ra)、卡介苗菌株(BCG)以及PhoP缺失突變株在感染巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的時(shí)間都較H37Rv菌株縮短[13]。這表明PhoPR TCS在不同毒力菌株中調(diào)控結(jié)核桿菌的毒力可能存在差異，但是目前關(guān)于在不同毒力結(jié)核桿菌菌株中PhoPR TCS調(diào)控細(xì)菌的毒力基因的表達(dá)差異的變化未見明確的報(bào)道。

3 PhoPR TCS與結(jié)核桿菌的脂質(zhì)

結(jié)核桿菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，它不含有內(nèi)毒素，也不會分泌外毒素和侵襲性酶類，其致病性主要與占細(xì)胞壁干重60%以上的脂質(zhì)成分密切相關(guān)。這些脂質(zhì)物質(zhì)不但有助于結(jié)核桿菌抵御外界不利的生活環(huán)境，同時(shí)也在細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)過程中發(fā)揮了重要作用。PhoPR TCS調(diào)控的多數(shù)靶基因參與合成以?；Ｔ逄菫榛疚镔|(zhì)的脂質(zhì)。而在PhoP基因缺失突變菌株中因不能夠合成以?；Ｔ逄菫榛疚镔|(zhì)的脂質(zhì)[14]，導(dǎo)致其毒力減弱。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PhoPR TCS正性調(diào)控的基因如pks3, rv1184c, fadD21和pks2都參與了以?；Ｔ逄菫榛疚镔|(zhì)的脂質(zhì)合成[15]。此外，PhoPR TCS調(diào)控的fas基因編碼一種脂肪酸合成酶，這個酶可以與FAS II系統(tǒng)聯(lián)合促使結(jié)核桿菌前體細(xì)胞合成分枝菌酸。而分枝菌酸是細(xì)菌胞壁的主要成分，其與海藻糖構(gòu)成了海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate,TDM)或稱為“索狀因子”(cord factor)。后者可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生肉芽組織、影響細(xì)胞膜的融合并對線粒體有毒性作用[16]。

4 PhoPR TCS與宿主巨噬細(xì)胞的相互作用

結(jié)核桿菌通常形成氣溶膠方式經(jīng)呼吸道感染宿主，進(jìn)入肺臟的細(xì)菌可被巨噬細(xì)胞吞噬。其中大部分細(xì)菌可以被巨噬細(xì)胞殺死并清除到體外。但有少量的結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活下來，但是其生存將會遭遇細(xì)胞內(nèi)不利環(huán)境的挑戰(zhàn)，包括活性氧/氮，酸性環(huán)境、低氧、營養(yǎng)缺乏等。結(jié)核桿菌為了逃避這些惡劣的生存環(huán)境，可以通過免疫逃避、休眠、以及降低自我增殖等多種應(yīng)對方式避免宿主巨噬細(xì)胞對其殺傷，從而持久的寄生在細(xì)胞內(nèi)。其中PhoPR TCS是結(jié)核桿菌感知微環(huán)境變化的主要系統(tǒng)，結(jié)核桿菌可通過這個系統(tǒng)對感知到的變化信息進(jìn)行分析處理后，并調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)來使細(xì)菌適應(yīng)微環(huán)境的改變。因此結(jié)核桿菌PhoPR TCS與宿主巨噬細(xì)胞的相互作用對結(jié)核桿菌在細(xì)胞內(nèi)的長期生存有著重要的作用。

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