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        熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法檢測(cè)HBV-DNA水平的應(yīng)用價(jià)值比較

        2014-01-26 09:13:02
        中外醫(yī)療 2014年30期
        關(guān)鍵詞:乙型肝炎分型基因型

        劉 青

        黃河中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南鄭州 450003

        乙型病毒性肝炎是世界常見(jiàn)的感染性疾病之一,全球約有3.5億慢性感染患者[1],我國(guó)乙型肝炎病毒感染患者約有1.2億,每年死于HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭及肝癌的患者約有100萬(wàn)[2]。根據(jù)HBV-DNA全基因組序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%,臨床上一般將HBV分為A~H型,共計(jì)8個(gè)基因型[3],我國(guó)主要分布的是B型、C型以及B、C混合型。對(duì)HBV感染患者進(jìn)行正確分型,是指導(dǎo)下一步診斷治療的重要依據(jù)。目前,臨床上常用的有熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法。為比較熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法檢測(cè)HBV-DNA水平的應(yīng)用價(jià)值。該研究2012年1月—2013年12月間擬通過(guò)對(duì)該院收治的126例HBV患者分別采用熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法檢測(cè)HBV-DNA水平,以比較兩種方法的應(yīng)用價(jià)值,報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取該院收治的126例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的HBV患者,其中男性 74 例,女性 52 例;年齡為 21~64 歲,平均(48.13±10.72)歲;病程為 6 個(gè)月~6 年,平均(2.67±0.47)歲。

        1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

        ①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)關(guān)于乙型病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];②HBsAg陽(yáng)性;③排除心、肺、腎等功能?chē)?yán)重障礙患者;④排除妊娠及哺乳期女性患者;⑤排除合并其他可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響的疾病患者;⑥自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

        1.3 主要儀器和試劑

        主要儀器包括CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀 (美國(guó)Bio-Rad公司),ABI3100基因分析儀(美國(guó)ABI公司)。主要試劑包括Premix Taq PCR擴(kuò)增試劑盒及DNA Marker(TaKaRa公司)。

        1.4 檢測(cè)方法

        采集HBV患者空腹靜脈血,離心,利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒從血清中提取HBV-DNA,溶于DEPC處理水,-20℃保存。

        1.4.1 熒光定量分型PCRPCR反應(yīng)總體積20μL,包括PCR反應(yīng)混合液10μL,DNA模板 2μL,0.3μmol/LB型探針 2μL,0.3μmol/L C型探針 2μL,0.5μmol/LB、C型引物 2μL。CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,CFXManagerTM1.1軟件行數(shù)據(jù)分析處理。

        1.4.2 直接測(cè)序法 選用引物對(duì)基因S區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性處理5min,55℃處理30s,72℃處理30s。雙脫氧鏈末端終止法擴(kuò)增測(cè)序片段并純化,ABI3100基因分析儀進(jìn)行序列分析。采用NCBI工具行基因分型。

        1.4.3 TA克隆 若樣本經(jīng)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致,則行TA克隆,挑選20~40個(gè)陽(yáng)性克隆,對(duì)單菌落測(cè)序進(jìn)行基因型檢測(cè)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)方法

        采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和處理。率的比較采用χ2檢驗(yàn),兩種檢測(cè)方法基因分型結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 基因分型

        126份樣本經(jīng)兩種方法檢測(cè)均成功分型,只檢測(cè)出3種基因分型(B型、C型、B/C混合型),其中B型占明顯優(yōu)勢(shì)。熒光定量分型PCR法B/C混合型檢出率明顯高于直接測(cè)序法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)表1。

        表1 兩種檢測(cè)方法HBV-DNA基因分型結(jié)果比較[n(%)]

        2.2 結(jié)果一致性檢驗(yàn)

        對(duì)兩種檢測(cè)方法的HBV-DNA基因分型結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn),Kappa>0.75,表明兩種檢測(cè)方法的一致性較好,見(jiàn)表2。

        表2 兩種檢測(cè)方法HBV-DNA基因分型結(jié)果一致性檢驗(yàn)(n)

        2.3 TA克隆

        共計(jì)23份樣本經(jīng)兩種方法檢測(cè)的HBV-DNA基因分型結(jié)果不一致,從中隨機(jī)抽選8份樣品(熒光定量分型PCR法檢測(cè)結(jié)果為B/C混合型,直接測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果為單一基因分型)進(jìn)行TA克隆,分別選出30個(gè)克隆之后進(jìn)行測(cè)序的基因型,結(jié)果示8分樣品均存在B/C混合感染,該結(jié)果與熒光定量分型PCR法一致。

        3 討論

        乙型肝炎病毒是雙鏈DNA病毒,可導(dǎo)致急、慢性肝炎、肝硬化以及肝癌,其基因序列高度變異,這是因?yàn)镠BV的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性,復(fù)制過(guò)程中可產(chǎn)生大量的核苷酸錯(cuò)配,HBV的變異率比其他DNA病毒高10倍以上[5]。我國(guó)大陸地區(qū)主要以B和C基因型為主,南方以B基因型為主,北方則以C基因型為主,有研究表明我國(guó)寧夏地區(qū)、廣東地區(qū)及香港地區(qū)約有15%的乙肝病毒感染者基因型為D型[6]。也有研究表明肝癌患者中的C基因型比例明顯高于慢性乙型肝炎患者中的C基因型比例[7],而在乙型肝炎病毒攜帶者中未檢測(cè)到C基因型,因此對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型,對(duì)乙型肝炎患者的治療及預(yù)后判斷具有重要意義。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了多種乙型肝炎病毒耐藥變異及基因分型的檢測(cè)方法,主要包括直接測(cè)序法、PCR分型法、聚合酶反應(yīng)法、雜交法及酶聯(lián)免疫法[8]。DNA直接測(cè)序法,被公認(rèn)為HBV基因耐藥變異檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),既可以得到已知變異點(diǎn)的信息,還可以提示可能的未知的耐藥變異位點(diǎn),但缺點(diǎn)是靈敏性差,當(dāng)變異株超過(guò)HBV準(zhǔn)種池的20%時(shí)才能被發(fā)現(xiàn)。熒光定量分型PCR法是一種新興的應(yīng)用于臨床的方法,目前主要包括兩種方法,即溶解曲線(xiàn)法和特異性探針?lè)?。熒光定量分型PCR法特異性和敏感性均較好,操作相對(duì)較簡(jiǎn)便,降低了檢測(cè)過(guò)程中受污染的可能性,逐漸在臨床上推廣應(yīng)用。該研究通過(guò)對(duì)126例HBV患者分別采用熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法檢測(cè)HBV-DNA水平,發(fā)現(xiàn)熒光定量分型PCR法B/C混合型檢出率(25.40%)明顯高于直接測(cè)序法(7.14%),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);TA克隆結(jié)果與熒光定量分型PCR法一致。該結(jié)果表明,熒光定量分型PCR法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,與直接測(cè)序法相比,對(duì)于混合型HBV-DNA檢出率明顯占優(yōu)勢(shì),敏感性較高。綜上所述,熒光定量分型PCR法檢測(cè)HBVDNA水平應(yīng)用價(jià)值較直接測(cè)序法高,值得臨床推廣應(yīng)用。

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