連娜琦，吳夏飛，陸春風(fēng)，張 峰，陸 茵，2，鄭仕中，2

肝損傷是肝纖維化發(fā)生的第一步，當(dāng)肝臟受到病毒、藥物、酒精等致病因素的損傷后，引發(fā)多種肝細(xì)胞參與的肝損傷修復(fù)反應(yīng)，其理想狀態(tài)是受損的肝臟上皮細(xì)胞被新生健康的上皮細(xì)胞替代以完成肝組織再生，肝臟祖細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮了重要作用［1］。然而，肝臟含有大量的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，而間質(zhì)細(xì)胞的參與往往引發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)、血管重構(gòu)和肝臟形態(tài)異常及功能障礙，并最終導(dǎo)致肝纖維和肝硬化的發(fā)生［2］。Hh信號通路［3－5］是一條具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷徙和分化功能的信號通路，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)它能在各種急性及慢性肝損傷所致的肝臟疾病中被激活，并參與肝損傷修復(fù)反應(yīng)的多方面過程，包括肝祖細(xì)胞的增殖，肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與生成，肝臟多種細(xì)胞的凋亡，肝損傷引起的炎癥反應(yīng)以及血管重塑過程等。本文就近年來Hh信號通路參與肝損傷修復(fù)反應(yīng)的機(jī)制研究作一綜述，并對其可能的藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行展望。

1 Hh信號通路

Hh信號通路［6］由Hh蛋白、靶細(xì)胞膜上兩種蛋白受體（Patched，Ptc）和（Smoothened，Smo）及 3種鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Gli1，Gli2，Gli3）組成。哺乳動(dòng)物中存在3種Hh的同源基因（Sonic Hedgehog，SHH）、（Indian Hedgehog，IHH）和（Desert Hedgehog，DHH），它們分別編碼 Shh、Ihh和 Dhh蛋白。Hh蛋白家族成員均由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：氨基端結(jié)構(gòu)域（Hh-N）及羧基端結(jié)構(gòu)域（Hh-C），其中Hh-N有Hh蛋白的信號活性，而Hh-C則具有自身蛋白水解酶活性及膽固醇轉(zhuǎn)移酶功能。Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受靶細(xì)胞膜上兩種跨膜蛋白控制。正常情況下［7］，驅(qū)動(dòng)蛋白樣分子（Costal2，Cos2）、絲／蘇氨酸激酶（Fused，F(xiàn)us）、絲／蘇氨酸激酶抑制因子（Sufu）及 Gli，然后以Gli為主形成了一個(gè)大的Cos2復(fù)合物錨定于微管上。定位于細(xì)胞內(nèi)小泡的Smo，可通過Hh－C端直接與Cos2蛋白復(fù)合物作用，Ptc與Smo結(jié)合，Smo活性被抑制，此時(shí)下游的Hh信號的終端傳遞者Gli蛋白在蛋白酶體內(nèi)被截?cái)?，并以羧基端被截?cái)嗟男问竭M(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典的Hh活化機(jī)制是［7］，Hh配體先合成前肽，經(jīng)過自動(dòng)的催化裂解產(chǎn)生一個(gè)N-末端片段，再經(jīng)膽固醇和異戊烯基脂質(zhì)修飾后轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜并釋放到胞外。Ptc與Hh結(jié)合解除Ptc對Smo的抑制作用，促使Gli蛋白、蛋白激酶A、激活的Smo、Cos2、Fus、Sufu形成復(fù)合物并從微管上解離出來，全長Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。下游靶基因包括纖維生長因子、胰島素樣生長因子2、細(xì)胞周期蛋白D1、Hh相互作用蛋白（hedgehog-interaction protein，Hhip）等［8］。Hhip作為抑制因子能夠與Ptc競爭性結(jié)合Hh配體，降低Hh配體激活Hh信號通路的能力［9］。

經(jīng)典的Hh信號通路活化依賴于Hh配體解除Ptc對Smo的抑制作用從而活化信號通路，然而，還存在另一種活化機(jī)制［10］，如轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）在沒有活化Smo的前提下直接使Gli轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，同時(shí)Hh轉(zhuǎn)錄因子也可影響TGF-β靶基因以及Wnt信號通路相關(guān)因子的表達(dá)［11］。另外，有研究［12］稱胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）有抑制GLI磷酸化降解的作用，而表皮生長因子［13］（epidermal growth factor，EGF）能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞表達(dá) Shh。IGF、EGF、TGF-β均是目前已知的與肝臟再生相關(guān)的因子［14］。綜上所述，Hh信號通路是一個(gè)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)中的一部分，它與TGF-β和Wnt等信號通路共同參與調(diào)節(jié)肝臟損傷修復(fù)過程。

2 Hh信號通路在肝損傷中的作用

臨床上常見的慢性持續(xù)性的肝臟損傷，肝功能損害表現(xiàn)明顯，肝細(xì)胞損傷范圍廣、數(shù)量多、無法僅僅依靠肝細(xì)胞再生完成修復(fù)，往往需要在非實(shí)質(zhì)性的細(xì)胞協(xié)助下進(jìn)行結(jié)締組織的瘢痕修復(fù)。而反復(fù)持續(xù)的慢性肝損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死增多、肌成纖維細(xì)胞活化增殖及大量的膠原纖維沉積，最終導(dǎo)致肝臟廣泛的纖維化，甚至肝硬化［15］。Wynn等［16］近期針對成人或是動(dòng)物肝硬化的大量研究，已證明肝硬化的肝臟中Hh信號通路處于激活狀態(tài)，同時(shí)Hh信號通路也參與調(diào)節(jié)了肝臟損傷修復(fù)的多個(gè)方面。

2.1 Hh信號通路促進(jìn)肝祖細(xì)胞生成

普遍認(rèn)為，包括卵圓細(xì)胞和未成熟的膽管細(xì)胞在內(nèi)的肝祖細(xì)胞群對慢性肝損傷肝臟再生具有重要意義［17］。然而到目前為止，對受損肝臟如何動(dòng)員此類細(xì)胞的機(jī)制卻所知甚少。健康成年人的肝臟中含有少量的肝祖細(xì)胞群，它們集中在Hering管中。免疫組化分析結(jié)果顯示Hh配體、Hh調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子和 Hh靶基因在 Hering管中表達(dá)［18］。相關(guān)研究［1］證實(shí)了肝祖細(xì)胞是Hh配體的受體細(xì)胞，它們依賴Hh信號通路維持活性，Hh配體可抑制這些細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖。Ochoa等［19］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hh信號通路抑制劑環(huán)杷明使肝臟部分切除（partial hepatectomy，PH）處理過的小鼠體內(nèi)肝祖細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白、角蛋白的表達(dá)減少。除了在急性肝損傷模型中發(fā)現(xiàn)Hh對肝祖細(xì)胞的影響外，F(xiàn)leig等［18］通過慢性動(dòng)物肝損傷模型也得出Hh配體促進(jìn)肝祖細(xì)胞生成的結(jié)論。有報(bào)道［20］稱喪失使Hh信號通路恢復(fù)安靜能力的肝損傷轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)肝祖細(xì)胞大量增殖。另外，大量的研究［21－25］顯示各種慢性肝損傷疾病如原發(fā)性膽汁性肝硬化、酒精性脂肪性肝硬化、非酒精性脂肪肝以及慢性乙肝病毒性肝炎和丙肝病毒性肝炎中也存在Hh信號通路激活和肝祖細(xì)胞生成的這種關(guān)系，即Hh信號通路可通過促進(jìn)肝祖細(xì)胞增殖發(fā)揮使受損肝細(xì)胞被新生健康肝細(xì)胞替換的作用。由于Hh信號通路在各種急、慢性肝損傷動(dòng)物模型及慢性肝損傷疾病中均顯示了對肝祖細(xì)胞的重要作用，而肝祖細(xì)胞被認(rèn)為是新生肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞再生的主要來源。因此我們推測Hh信號通路可作為抑制不利于急慢性肝損傷疾病恢復(fù)的肝臟再生性修復(fù)反應(yīng)的理想藥物作用靶標(biāo)。

2.2 Hh信號通路的激活是上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的重要調(diào)節(jié)機(jī)制 肌成纖維細(xì)胞在肝臟損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。曾經(jīng)我們認(rèn)為只有靜止的肝星狀細(xì)胞（quiescent hepatic stellate cell，Q-HSC）才能活化成為肌成纖維樣肝星狀細(xì)胞（myofibroblast-hepatic stellate cell，MF-HSC）。進(jìn)一步研究［26］發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的來源還包括肝祖細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞以及竇狀內(nèi)皮細(xì)胞等。它們通過一個(gè)共同的機(jī)制即上皮－間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換過程（epithelial-mesenchymal transition，EMT），由具有上皮表型的 Q-HSC、肝祖細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞以及竇狀內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的成熟肌成纖維細(xì)胞［27］。

MF-HSC是肝臟內(nèi)主要的肌成纖維細(xì)胞。慢性肝臟損傷時(shí)，HSC被激活并產(chǎn)生大量膠原基質(zhì)從而促進(jìn)肝纖維化的形成。因此，HSC的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。關(guān)于Hh信號通路在肝星狀細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT的機(jī)制已經(jīng)有過系統(tǒng)的研究。Q-HSC具有一些間質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，它們表達(dá)結(jié)蛋白和其它一些間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子［26］。然而，Q-HSC卻不表達(dá)典型的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因，包括α-SMA和膠原蛋白1A1（collagen 1A1，col1A1），而表達(dá)氧化物酶體增生物激活受體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、E-鈣粘蛋白和角蛋白這些上皮型細(xì)胞標(biāo)志物［26］，這說明Q-HSC是上皮型細(xì)胞。另有研究證明［28］Q-HSC表達(dá)高水平的Hhip，而Hh配體和其他Hh靶基因如Glis的mRNAs幾乎檢測不到。將Q-HSC細(xì)胞在含有血清的基質(zhì)中培養(yǎng)24 h后，Hhip的表達(dá)下降90%，并伴隨著Shh的產(chǎn)生和Hh信號通路的激活，當(dāng)Hh信號通路活化后，負(fù)向調(diào)節(jié)靜止／上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)并逐漸上調(diào)肌成纖維母細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，包括α-SMA、col1A1、波形蛋白和snail（一種能介導(dǎo) TGF-β誘導(dǎo)EMT的Gli敏感的轉(zhuǎn)錄因子）。當(dāng)Q-HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細(xì)胞后，給予細(xì)胞的Hh信號通路特異性抑制劑環(huán)杷明，結(jié)果是間質(zhì)表型標(biāo)志物基因表達(dá)降低，上皮表型標(biāo)志物基因表達(dá)恢復(fù)，引起MF-HSC遷徙／浸潤表型消失，環(huán)杷明明顯抑制 HSC的活化［28］。除了HSC，Hh信號通路還可促進(jìn)未成熟的膽管上皮細(xì)胞產(chǎn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），這種因子具有募集單核細(xì)胞／成纖維細(xì)胞的功能［29］。而白介素-13（interleukin-13，IL-13）能夠促進(jìn)單核細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，有報(bào)道稱Hh信號通路正向調(diào)節(jié)IL-13的表達(dá)［30］。Ochoa等［19］利用PH急性肝損傷模型發(fā)現(xiàn)Hh激活的同時(shí)也伴隨著肌成纖維數(shù)量增多和細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，而這種現(xiàn)象卻因環(huán)杷明的干預(yù)而消失。Philips等［31］給以 Mdr2（－／－）小鼠（Mdr2基因敲除的肝損傷模型小鼠）Hh信號通路的特異性小分子抑制劑GDC-0449能減少肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量。Omenetti等［29］發(fā)現(xiàn)在Hh信號通路持續(xù)激活的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)積累了大量的肌成纖維細(xì)胞。綜上所述，由肝損傷引起Hh信號通路活化是肌成纖維細(xì)胞生成的重要因素。

2.3 Hh信號通路與肝臟血管重塑 近年來基礎(chǔ)與臨床研究均證實(shí)，肝纖維化時(shí)發(fā)生病理性血管生成與肝竇重構(gòu)，對于肝纖維化的進(jìn)展及治療預(yù)后有重大影響［32］。調(diào)控肝纖維化病理性血管生成極有可能成為防治肝纖維化的全新策略。存在于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞周圍的受損肝細(xì)胞，活化的HSC，肝祖細(xì)胞及一些固有淋巴細(xì)胞均有產(chǎn)生Hh配體的能力。Vokes等［33］認(rèn)為在胚胎發(fā)育期Hh信號通路就有促進(jìn)血管發(fā)生的作用。能夠激活肝臟細(xì)胞群中Hh信號通路的血小板衍生因子具有調(diào)節(jié)肝臟血管構(gòu)建的作用也得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)［34］。Xie等［3］利用 Hh信號通路激動(dòng)劑，抑制劑環(huán)杷明、5E1、GDC-0449，以及利用腺病毒使Smoloxp／loxp轉(zhuǎn)基因小鼠Smo表達(dá)沉默等方法控制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）中Hh信號通路的活性，探究 Hh信號通路對LSEC血管發(fā)生的影響，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在肝損傷的小鼠模型中，所有使Hh信號通路安靜的手段都能抑制LSEC血管生成。近年來有關(guān)HSC促進(jìn)與肝纖維化相關(guān)的血管生成說法也引起了關(guān)注。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［35］在膽管結(jié)扎所致的肝纖維化大鼠將來源于HSC或未成熟的膽管上皮細(xì)胞的含有Hh配體的膜質(zhì)顆粒釋放到血漿和膽汁中。有趣的是［35］，這些膜質(zhì)顆粒能促進(jìn)LSEC發(fā)生毛細(xì)血管化。血管新生在不同損傷因素導(dǎo)致的肝纖維化中普遍存在，其既是慢性肝損傷后組織修復(fù)過程中血管重塑的重要表現(xiàn)，也與纖維化發(fā)展及并發(fā)癥密切相關(guān)。因此研究Hh信號通路對血管新生在肝纖維化病理過程中的作用將有助于深入揭示肝纖維化的病理機(jī)制，為尋找到有效的診斷標(biāo)志、治療靶點(diǎn)以及藥物干預(yù)治療提供嶄新的視角。

2.4 Hh信號通路與肝臟細(xì)胞的凋亡 肝損傷過程中，出現(xiàn)大量的肝實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。有報(bào)道稱［36－37］Hh信號通路能夠抑制多種肝細(xì)胞凋亡。其中尤為典型的屬膽管細(xì)胞。膽管細(xì)胞是Hh信號通路的感應(yīng)細(xì)胞。Hh信號通路通過GLI3與死亡受體-4（death receptor-4，DR4）啟動(dòng)子結(jié)合抑制DR4的轉(zhuǎn)錄，負(fù)向調(diào)節(jié)miR-29b促進(jìn)抗凋亡因子（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）的表達(dá)發(fā)揮抗膽管細(xì)胞凋亡的作用［38］。除了膽管細(xì)胞，Hh信號通路對肝星狀細(xì)胞凋亡也有抑制作用［17］，然而其機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。研究人員發(fā)現(xiàn)［39］給以肝癌細(xì)胞Hh配體中和抗體5E1和環(huán)杷明后，肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡?？傊琀h信號通路對各類肝臟細(xì)胞存活機(jī)制均有調(diào)節(jié)作用，其中主要是抑制凋亡作用。然而，若活化的肝星狀細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的凋亡受到抑制將導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重化，因此可通過抑制Hh信號通路的活化治療肝損傷引起的肝臟疾病。

2.5 Hh信號作為肝損傷的治療靶點(diǎn) 既然肝損傷時(shí)Hh信號通路的過度激活參與其發(fā)病過程，調(diào)控Hh的活性自然成了肝損傷治療的一個(gè)靶點(diǎn)。鑒于Hh信號通路的激活途徑和以上提及的實(shí)驗(yàn)研究，目前應(yīng)用于Hh參與肝損傷修復(fù)機(jī)制研究的抑制劑主要是5E1、環(huán)杷明和GDC-0449這3種。Hh配體的中和抗體5E1阻斷了Hh配體與Ptch結(jié)合這一過程［3］。環(huán)杷明［3］是一種異甾體類生物堿，通過與 Hedgehog信號通路中的Smoothened蛋白結(jié)合抑制該蛋白活性發(fā)揮阻斷Hedgehog信號通路的作用。而GDC-0449［40］作為一種新型及特定合成的小分子抑制劑，作用于Hedgehog信號通路，阻斷Hedgehog配位體，即細(xì)胞表面受體Ptc及Smo的活性，從而阻斷Hedgehog信號通路。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，肝臟的損傷修復(fù)反應(yīng)同機(jī)體的其它組織一樣是各類細(xì)胞協(xié)同作用的結(jié)果。在肝臟中，這些細(xì)胞包括肝祖細(xì)胞、膽管細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞等。Hh信號通路作用于這些細(xì)胞并且參與肝損傷修復(fù)過程中的各個(gè)方面的說法也得到了大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。然而，將Hh作為一個(gè)肝損傷治療靶點(diǎn)雖然在實(shí)驗(yàn)研究方面取得了較好的效果，但是若想以Hh信號通路為治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床治療肝損傷疾病，仍存在一些亟待解決的問題。首先，從肝臟疾病的治療角度考慮，Hh信號通路在一定程度上的激活是機(jī)體生理需要和防御反應(yīng)的表現(xiàn)，但過度激活則促進(jìn)肝損傷的重癥化及各種并發(fā)癥的發(fā)生。因此，今后的實(shí)際應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)針對不同原因的肝損傷疾病探討其發(fā)病過程中Hh活性的變化規(guī)律，為Hh靶向治療中選擇病程中恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)和適量的Hh抑制劑提供參考，從而達(dá)到精確調(diào)控Hh的活化，使其活性既處于正常的生理或防御功能狀態(tài)，又不至于介導(dǎo)過度的促纖維化反應(yīng)的治療效果。其次，雖然以環(huán)杷明，5E1及GDC-0449為代表的Hh信號通路抑制劑在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對肝損傷疾病的療效顯著，然而至今鮮有關(guān)于它們作為臨床用藥治療肝損傷的報(bào)道。因此，還需要進(jìn)一步闡明Hh介導(dǎo)的肝損傷修復(fù)機(jī)制，使開發(fā)以Hh為靶標(biāo)治療肝損傷疾病的臨床藥物成為可能。雖然目前關(guān)于Hh信號通路與肝損傷的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，但仍具有非常廣闊的應(yīng)用前景和治療價(jià)值。

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