高 舉，劉弋

目前，嚴重感染導致膿毒癥以及敗血癥的發(fā)生并最終出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征 (SIRS)合并免疫失控還缺乏切實可行的治療方法［1-6］。為探討血漿血小板活化因子 (PAF)、降鈣素原 (PCT)等內源性遞質以及一氧化氮 (NO)水平在發(fā)生炎癥反應時的變化，明確其與腹腔感染程度的相關性，通過干預前后水平變化來觀察大黃素能否通過降低血漿內毒素水平來改變機體免疫反應以及通過對腹腔嚴重感染狀態(tài)下自由基如:NO水平測定觀察這類藥物是否具有穩(wěn)定腹腔嚴重感染狀態(tài)時體內自由基釋放-清除機制及氧化-抗氧化機制。為此，本實驗通過制作腹腔嚴重感染模型，研究大黃素干預前后血漿PAF、PCT、NO水平的變化規(guī)律，為臨床有針對性地采取有效治療措施提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康無特定病原體級 (SPF)雄性SD大鼠36只，年齡 (81．0±11．6)d，體質量 (303±43)g(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)。所有大鼠實驗前在中科院動物飼養(yǎng)中心適應性飼養(yǎng)1周，且經中科院倫理委員會批準。實驗前禁食12 h，自由飲水，按照100 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉。

1．2 實驗藥物及試劑 大黃素購自美國Sigma公司，純度＞98%，批號:E8772。四磨湯為湖南漢森制藥有限公司生產，購自航空總醫(yī)院藥房，批號:1302118546，10 ml/支。頭孢他啶為哈藥集團制藥總廠生產，購自航空總醫(yī)院藥房，批號為:1301022，0．5 g/支。酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)試劑盒購自北京中昊時代生物科技中心。

1．3 方法

1．3．1 腹腔嚴重感染模型制備 腹腔嚴重感染是指合并膿毒癥與膿毒癥休克的腹腔感染，多發(fā)生于消化道穿孔、破裂等繼發(fā)性腹膜炎［7］。造模采用公認的盲腸結扎穿孔術 (CLP)制作腹腔嚴重感染模型［8-9］。麻醉滿意后，取腹部正中縱行切口，逐層切開進入腹腔，仔細辨別尋找盲腸，游離盲腸系膜過程中需注意避免損傷回盲腸血管，提起盲腸將其放置于腹腔外，保護腹腔防止污染。在盲腸中部約1/2處用0#絲線結扎后用16 G針頭在盲腸結扎線與盲腸末端中間行貫通性穿刺，穿刺過程中避免損傷血管。將少量盲腸內容物從兩側針孔輕輕擠出，確保穿孔部位完全開放，制模過程中使每只大鼠擠出內容物的量一致，再將盲腸還納入腹腔，分層縫合腹壁切口，術畢。術后各組動物均自由進食、飲水。術后每日靜脈推注頭孢他啶溶液(20 mg/kg)。

1．3．2 實驗分組及治療 將36只大鼠隨機分為:空白組、對照組、大黃素組，每組12只。空白組:術后第1天開始0．9%氯化鈉溶液 (5 Ml/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。對照組:術后第1天開始四磨湯 (5 ml/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。大黃素組:術后第1天開始大黃素 (1．5 mg/kg)灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。

1．4 血標本的采集與檢測 腹腔嚴重感染大鼠治療前、治療后72 h從尾靜脈抽取靜脈血10 ml注入肝素抗凝無菌瓶中，4 000 r/min離心10 min，離心半徑84 mm，取上清液送檢。PAF、PCT、NO水平檢測采用ELISA法，采用Thermo Multiskan MK3公司的全自動酶標儀，以上操作方法均嚴格按試劑說明書進行。

1．5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據處理，計量資料以 (±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

治療前，3組大鼠PAF、PCT、NO水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05)。治療后，3組大鼠PAF、PCT、NO水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05);其中對照組、大黃素組 PAF、PCT、NO水平較空白組降低，大黃素組 PAF、PCT、NO水平較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0．05，見表 1)。

3 討論

目前，研究表明PAF、PCT、NO作為炎性指標，廣泛運用在腹腔嚴重感染的診斷和治療中［10-12］。PCT是一種人類降鈣素的前體物質，PCT水平升高的幅度與全身細菌感染程度呈正相關。目前普遍認為PCT較腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等其他檢測指標更靈敏、更準確［10，13-14］。本實驗中大黃素組與對照組均有治療效果，治療后PCT水平下降，但大黃素組較對照組治療效果更明顯。實驗結果說明大黃素能夠有效控制機體的炎性反應。其作用機制與大黃素降低血中炎性遞質水平聯(lián)合腸道去污降低全身細菌感染程度有關。

PAF是一種內源性脂性遞質，具有廣泛的生物學特性［15］。多數(shù)研究認為PAF在諸多參與胃腸黏膜損害的炎性遞質中起到“中心放大”的介導作用，誘導并加速炎性反應的發(fā)生、發(fā)展，其顯著增多可以產生中性粒細胞、活性氧、白三烯等大量炎性遞質［16-19］。本實驗中腹腔嚴重感染大鼠PAF水平升高也驗證了PAF能夠誘導、啟發(fā)并且擴大靶細胞的炎癥，大量炎性細胞因子的產生短時間內激起炎性反應發(fā)生，使得免疫自穩(wěn)態(tài)迅速遭到破壞，機體免疫自穩(wěn)態(tài)被打破從而引起免疫的亢進或抑制，進一步導致炎性反應失控，最終引起多器官功能障礙。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一類廣泛存在于細胞膜的磷脂水解酶，催化甘油磷脂上二位 (Sn-2)不飽和酰酯鍵水解，形成一分子溶血卵磷脂和一分子游離脂肪酸，溶血卵磷脂繼而轉化為PAF［20-21］，大黃素降低PAF水平可能與其具備降低PLA2能力有關。本實驗結果顯示大黃素組與對照組治療后PAF水平下降，而大黃素組較對照組治療效果更明顯。

表1 3組大鼠治療前后PAF、PCT、NO水平比較 (±s)Table 1 Comparison of levels of PAF，PCT and NO among 3 groups of rats before and after treatment

注:PAF=血小板活化因子，PCT=降鈣素原，NO=一氧化氮;與空白組比較，*P＜0．05;與對照組比較，△P＜0．05

治療后空白組 12 2．51 ±0．21 2．48 ±0．25 147 ±15 146 ±15 10．45 ±1．32 9．90 ±1．25組別 只數(shù) PAF(ng/ml)治療前 治療后PCT(ng/ml)治療前 治療后NO(mmol/L)治療前對照組 12 2．48 ±0．30 2．26 ±0．25* 150 ±14 132 ±12* 10．82 ±1．56 7．50 ±0．83*大黃素組 12 2．65±0．25 2．15±0．22＊△ 145±15 116±11＊△ 10．32±1．06 6．20±0．75＊△F 值0．112 0．036 0．071 0．012 0．142 0．025 2．34 3．67 2．87 5．11 2．07 4．15 P值

NO是一種內皮依賴性舒血管物質，炎性反應時會急劇增加，促進炎性反應發(fā)展，導致機體受損［22］。本實驗中造模后NO水平明顯升高，NO的過度增加導致低血壓和低灌流的發(fā)生，并容易與超氧陰離子自由基的反應生成細胞毒性物質造成自由基損傷作用，促進炎癥的發(fā)展，使得炎癥及免疫狀態(tài)無法自我調控恢復平衡狀態(tài)［23］。NO在體內由NO合成酶 (NOS)催化底物左旋精氨酸產生。大黃素已經被證明對NOS有較強的抑制作用，NO水平降低可能與大黃素通過抑制NOS的活性減少NO生成相關［24］。經過正確的治療NO水平會明顯降低，使內皮細胞、血小板等靶細胞對內毒素刺激和敏感性降低，使細胞因子及炎性遞質造成的損傷易于控制，最終達到促進機體恢復的目的。

本實驗進行過程中按實驗操作規(guī)范進行，模型制作按照通行盲腸結扎穿孔方法進行［25］。抽血及給藥方法亦均按照實驗規(guī)范進行，實驗數(shù)據為原始數(shù)據，實驗結果可信，與目前開展的同類研究得出的實驗結論基本符合。

嚴重感染極易引起膿毒癥發(fā)生，常誘發(fā)多器官功能障礙綜合征 (MODS)和SIRS的發(fā)生。目前，通常的治療為早期根據經驗采用廣譜抗生素治療同時做細菌培養(yǎng)，結果卻是效果欠佳，產生耐藥性，超級細菌不斷涌現(xiàn)［1-4］，這為感染性疾病的治療帶來很大的挑戰(zhàn)［26］。目前，國外對SIRS的研究仍然集中于抗體拮抗劑、烏司他丁、血液凈化技術、糖皮質激素、免疫營養(yǎng)支持、炎性相關基因多態(tài)性等治療方法。目前還大多限于實驗性研究，臨床上并沒有取得滿意的療效［27］。

大黃素是一種羥基蒽醌類的衍生物，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用。本實驗結果表明大黃素可以降低PAF、PCT等炎性遞質，改善NO水平，控制炎性反應，清除體內蓄積的毒素，從而達到改善內毒素血癥，調節(jié)體內失控的免疫反應的目的。提示通過抑制促炎細胞因子的生產從而降低炎性細胞因子和遞質來達到控制炎性損傷，逐步恢復臟器功能目的。其機制為推進肌肉收縮，引起腸道水分含量增加和黏液分泌增多導致腹瀉發(fā)生，從而清除炎性遞質以及腸道內積存毒素［23］，更關鍵的作用在于抑制脂多糖 (LPS)誘導促炎性反應來控制炎性反應的發(fā)生、發(fā)展，同時清除血液中炎性遞質和氧自由基達到恢復臟器功能，減少機體損傷的目的［28-29］。為臨床上治療腹腔嚴重感染尋找新思路提供了理論依據。

目前，大黃素已被證明具有廣泛應用前景，但對于其作用機制還處于探索階段，今后研究重點在于進一步明確大黃素對炎性遞質水平降低的具體機制，盡快開展臨床試驗，使之能夠盡快應用到臨床中來。

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