張 謝，宋毓飛，周 華，祁 峰，王丹萍，章雅丹，張宏宇，肖 健

（寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院1.消化內(nèi)科、2.藥劑科、3.骨科，浙江寧波 315040；4.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波 315211；5.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系，浙江 溫州 325035）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的治療一直是神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)難題，其致殘率與致死率非常高。自噬（autophagy）是一種細胞通過溶酶體降解途徑調(diào)控的細胞器和蛋白循環(huán)過程，其與衰老、免疫、細胞死亡和分化有關(guān)［1］。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促進血管生成、神經(jīng)保護、軸突再生、組織修復(fù)等作用。故本文研究bFGF與細胞自噬相關(guān)蛋白LC3在脊髓損傷修復(fù)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 重組 bFGF（Grost）；LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（Danvers）；anti-mouse IgG HRP（Santa Cruz）。

1.2 SCI動物模型制備及給藥 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（sham）、模型組（SCI）與bFGF給藥組。10%水合氯醛麻醉，血管夾夾住T9脊髓2 min。bFGF給藥組，SCI后立即皮下注射80μg·kg－1重組bFGF，之后每天給予同劑量至處死。SCI組注射同劑量0.9%NaCl。

1.3 BBB評分 用 BBB評分法［2］于術(shù)后 1、3、7 d獨立觀察大鼠雙后肢行動功能，并記錄分數(shù)（后肢全部癱瘓為0分，完全正常行走為21分）。

1.4 Western blot檢測 取脊髓損傷段0.1 g，加入1ml裂解液，取上清提取蛋白。LC3Ⅱ、LC3Ⅰ（1∶1 000）4℃孵育過夜，anti-mouse IgG HRP（1∶2 000）室溫孵育 2 h，曝光，觀察。

1.5 免疫熒光染色法 用10%驢血清室溫孵育1 h，LC3（1∶500）4℃孵育過夜，anti-mouse IgG HRP（1∶500）室溫孵育1 h，洗滌，觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 BBB評分結(jié)果顯示，術(shù)后1 d，SCI組和bFGF組BBB評分差異無顯著性；術(shù)后3 d，bFGF組BBB評分（6.3±0.6）高于 SCI組（2.7±0.7），P＜0.05；術(shù)后7 d，bFGF組大鼠可持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)行走（8.7±0.5），而SCI組大鼠后肢仍舊不能負重走動（5.7±0.7），P＜0.05。

2.2 bFGF通過抑制自噬相關(guān)蛋白LC3保護大鼠脊髓損傷

免疫熒光染色術(shù)后7 d結(jié)果顯示，與sham組相比，LC3蛋白在SCI組織中明顯增多，給予bFGF后下降。Western blot結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，SCI組LC3Ⅱ表達及 LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值明顯上升；但是此效果給予bFGF后明顯抑制。

3 討論

目前研究認為SCI產(chǎn)生兩種機制，即原發(fā)性損傷機制和繼發(fā)性損傷機制。繼發(fā)性損傷是指在原發(fā)性損傷后發(fā)生的一系列病理生理改變，包括組織缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)和組織水腫，最終導(dǎo)致細胞凋亡［3］。

自噬作為一種早期的自我適應(yīng)性機制，能清除受損的細胞器和蛋白，為組織穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量。近期的研究表明，在受壓迫性損傷的脊髓組織中，自噬標志蛋白LC3明顯增加；應(yīng)用缺氧條件模擬脊髓損傷，也能夠檢測到脊髓神經(jīng)元中LC3表達升高［4］。本文應(yīng)用重組bFGF于大鼠急性SCI模型中，同樣也發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后LC3表達增加，給予bFGF后，表達下降。研究表明，bFGF能夠通過抑制自噬相關(guān)蛋白LC3促進SCI大鼠后肢功能恢復(fù)，這對于開拓新的生長因子類藥物在脊髓損傷中的應(yīng)用有著重要的意義，相關(guān)研究國內(nèi)還未見報道。

參考文獻：

［1］ Meschini S，Condello M，Lista P，et al.Autophagy：molecular mechanisms and their implications for anticancer therapies［J］.Curr Cancer Drug Targets，2011，11（3）：357－79.

［2］ Basso D M，Beattie M S，Bresnahan J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12（1）：1－21.

［3］ Moon Y J，Lee JY，Oh M S，et al.Inhibition of inflammation and oxidative stress by Angelica dahuricae radix extract decreases apoptotic cell death and improves functional recovery after spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2012，90（1）：243－56.

［4］ Tanabe F，Yone K，Kawabata N，et al.Accumulation of p62 in degenerated spinal cord under chronic mechanical compression：functional analysis of p62 and autophagy in hypoxic neuronal cells［J］.Autophagy，2011，7（12）：1462－71.