陳伊凡 胡福良 編譯

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

蜂毒肽的抗癌作用及其機制

陳伊凡 胡福良 編譯

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

癌癥是危害人類健康的“頭號殺手”。目前，全世界每年死于癌癥的人數(shù)高達近1000萬。盡管現(xiàn)代醫(yī)學飛速發(fā)展，放療、化療等新的治療手段不斷涌現(xiàn)，但癌癥對人類健康仍然很致命，癌癥患病及死亡人數(shù)仍在逐年增加。因此，仍然需要繼續(xù)探索全新的抗癌藥物和治療方式。研究表明，從蛇、蝎子、海膽、珊瑚、蜘蛛、蜜蜂等動物（包括昆蟲）身上獲得的毒性物質具有殺死癌細胞的功能。蜂毒，尤其是蜂毒肽的抗癌作用及其機制研究越來越受到人們的關注。本文對近年來國外學者在蜂毒肽的抗癌作用及其機制方面的研究進展作一介紹，旨在為蜂毒的開發(fā)利用提供參考。

1.蜂毒肽

蜂毒是工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香氣味的一種透明毒液，貯存在毒囊中，蜇刺時由蜇針排出。蜂毒的化學成分極為復雜，是含有多種活性肽的復雜混合物，包括蜂毒肽、蜂毒明肽、安度拉平、肥大細胞脫顆粒肽等。此外，它也包括磷酸酶A-2（PLA2）、透明質酸酶、生物活性胺和和非肽成分，如脂類、碳水化合物、游離氨基酸等，都含有細胞活性。從20世紀30年代以來，蜂毒的化學成分和藥理學活性一直是研究的熱點。隨著化學分離方法的進步及分子水平和細胞水平研究的深入，蜂毒在其組分結構與功能方面不斷取得突破。

蜂毒肽（Melittin）是蜂毒的主要活性成分，約占干物質的50%。由紐曼（W.Neuman）和哈伯曼（E. Habermann）于1952年采用紙上電泳法首先從蜂毒中分離出來。蜂毒肽的化學分子式為C131H228N38O32，由26個氨基酸組成，分子量為2847.5 Da，有很強的溶血活性。其氨基酸序列為：Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-ProAla-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln。1971年，蜂毒肽已被人工合成，合成品的生物活性與天然品相同。

蜂毒肽是一種天然去垢劑，有著很大的表面張力。盡管它作為單體或四聚物時是水溶性的，但很容易破壞細胞膜，導致磷脂雙分子層結構的瓦解。這種蜂毒肽誘導的膜在形態(tài)學上的改變可能是由于荷爾蒙分泌的誘導，造成膜蛋白聚集和膜電勢的改變。此外，蜂毒肽能刺激各種不同的酶，包括G蛋白、蛋白激酶C、腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和D。蜂毒肽在蜜蜂毒腺內通常呈四聚物形式，而在細胞裂解時呈現(xiàn)單體。蜂毒肽四聚物能引起神經末梢去極化，從而產生痛覺。蜂毒肽還能增強PLA2的活性，并且對活細胞具有多樣化的作用。研究表明，蜂毒肽對造血系統(tǒng)相關細胞包括淋巴細胞、T細胞和紅細胞具有細胞毒性，對腸細胞也有毒性。此外，蜂毒肽能影響細胞的代謝功能并破壞質膜造成酶系統(tǒng)的變化；另一方面，它的細胞溶解性也可能與合并成細胞膜的磷脂雙分子層有關。

2.蜂毒肽的抗癌作用

早在1950年，Havas就報道了蜂毒的抗癌效果。McDonald等（1979）調查了接觸蜂毒的養(yǎng)蜂人的死亡率。結果發(fā)現(xiàn)，那些因為職業(yè)原因接觸蜂毒的養(yǎng)蜂人癌癥死亡率略低于正常人群，而患肺癌的死亡率遠遠低于正常人群，其他疾病的死亡率則基本一致，這一結果表明了蜂毒潛在的抗癌作用。之后，大量研究證明了蜂毒的抗癌作用并鑒定出其主要功效成分為蜂毒肽。蜂毒肽對癌細胞的毒性機理包括細胞周期變更、細胞增殖和生長抑制作用、誘導細胞凋亡和壞死等。

Mufson等（1979）研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽可能進入磷脂雙分子層，表現(xiàn)出表面活性。蜂毒肽能導致磷脂質?；钠茐模黾恿字笇α字獾拿舾行?，增強磷脂中釋放的花生四烯酸合成前列腺素的過程。

Hait等（1985）首次發(fā)現(xiàn)了蜂毒肽對癌細胞的體外抑制作用。他們發(fā)現(xiàn)蜂毒肽是鈣調蛋白抑制劑，可以抑制人類白血病細胞的增長和集落生成。Lee和Hait (1985)也注意到了蜂毒肽對星形細胞瘤細胞的生長抑制作用。Lazo等（1985）在白血病細胞中也觀察到了一個類似的機制。他們還發(fā)現(xiàn)蜂毒肽增強了人粒細胞巨噬細胞和紅細胞樣干細胞的博來霉素毒性。Lee和Hait（1985）研究還發(fā)現(xiàn)蜂毒肽的細胞毒性作用是與鈣調蛋白的拮抗作用成比例的。這些研究支持了鈣調蛋白的藥理作用，即作為蜂毒肽抗惡性細胞增殖作用的細胞內靶點。

Killion和Dunn（1986）研究發(fā)現(xiàn)白血病細胞比正常小鼠脾臟細胞和骨髓細胞對蜂毒肽更敏感，原因是骨髓細胞膜上碳水化合物的結合位點數(shù)量很大。這些結合位點在成年脾細胞中趨于減少，而在變成腫瘤后幾乎消失，從而使腫瘤細胞對于蜂毒肽更敏感。Zhu等（1991）觀察到蜂毒肽在一定濃度下抑制腫瘤細胞如肺癌細胞的增殖，但并不會阻止正常細胞的生長。這些細胞反應的差異表明，正常細胞和腫瘤細胞之間信號通路的激活是不同的。蜂毒肽已經被證明對培養(yǎng)中的Ras致癌基因表達水平高的成纖維細胞尤其有效，它也增強了Ras致癌基因轉化細胞的PLA2活性，導致選擇性摧毀這些細胞。這些結果顯示，蜂毒肽增強PLA2活性可以成為蜂毒肽細胞毒性對抗腫瘤細胞的目標。

研究證明蜂毒肽的細胞毒性對細胞壞死和凋亡都有效。蜂毒肽能導致血管平滑肌細胞核和肝癌細胞的凋亡。相反，蜂毒肽能造成大鼠胸腺細胞、小鼠骨骼肌細胞、胃腸腫瘤細胞的壞死，而壞死主要發(fā)生在紅細胞、類淋巴母細胞、淋巴細胞和大鼠肺泡細胞中。

3.蜂毒肽抗癌作用的機制

昆蟲產生的絕大多數(shù)裂解肽，包括從蜂毒中分離的肽，具有兩性分子屬性，它們通過造成缺陷、破壞或氣孔形成，擾亂細胞膜雙分子層的完整性。由此產生脂質雙分子層的開放將導致跨膜電化學梯度的崩潰。與正常細胞較低膜電位相比，腫瘤細胞膜有一個很高的膜電位。因此，與正常細胞相比，裂解肽在腫瘤細胞中更大程度選擇性破壞膜結構。蜂毒肽能夠在各種腫瘤細胞中誘導細胞周期阻滯、增長抑制、凋亡和壞死。它對人類肝細胞瘤和神經膠質瘤細胞系產生明顯的生長抑制和細胞毒性。在肝癌和骨肉瘤細胞株中，蜂毒肽通過上調線粒體膜蛋白7A6和Fas蛋白的表達誘導凋亡。

Moon等（2008）研究表明，蜂毒肽通過上調Bax和半胱天冬酶e-3激活和下調Bcl-2的凋亡蛋白（IAP）家族抑制劑，誘導白血病細胞凋亡；蜂毒肽誘導人白血病細胞凋亡的關鍵調節(jié)因子Bcl-2和半胱天冬酶-3是通過蛋白激酶信號通路控制的；蜂毒肽抑制體外前列腺癌可能與核因子-κappa B（NF-κB）/半胱天冬酶信號調節(jié)的凋亡細胞死亡誘導機制有關。蜂毒肽還通過半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的裂解誘導人肝癌細胞凋亡，但不包括半胱天冬酶-8，因為它可以被鈣螯合劑1,2-雙(鄰氨基苯)乙烷-N,N,N',N'-四乙酰酸鉀鹽和活性氧族（ROS）抑制劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）阻斷。這表明，蜂毒肽誘導的半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶的活性是由鈣流入和ROS產生初始化的。此外，蜂毒肽誘導的人肝癌細胞凋亡作用，抵抗腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配合基（TRAIL）誘導的細胞死亡是由鈣離/鈣調素依賴蛋白激酶（CaMKII），轉化成生長因子beta-激活的激酶-1（TAK1），和c-Jun氨基端激酶(JNK)/p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）造成的。蜂毒肽還增強了人肝癌細胞中TRAIL的凋亡作用，其機制是通過激活CaMKII-TAK1-JNK/p38信號通路，抑制IκBɑ激酶（IKK）-NF-κB通路。

蜂毒肽對經十四烷酸佛波醇酯（PMA）誘導入侵腎臟癌細胞，誘導基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達中表現(xiàn)出抑制作用，MMP-9在癌細胞入侵和新陳代謝中扮演了重要的角色。蜂毒肽通過阻斷PMA刺激的活化劑蛋白-1（AP-1）和NF-κB活性，抑制MMP-9基因表達。蜂毒肽也可以抑制PMA誘導的ERK和JNK絲裂原，活化蛋白激酶磷酸化。Jo等（2012）也報道了蜂毒肽可以通過加速死亡受體表達，誘導細胞凋亡來抑制卵巢癌細胞。研究發(fā)現(xiàn)，死亡受體下游促凋亡蛋白（半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8和Bax）的表達也增加，但是JAK激酶（JAK2）和信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT3)的磷酸化和Bcl-2的表達，在蜂毒肽處理后被抑制。

體內試驗結果表明，蜂毒肽在Balb/c裸鼠中產生顯著的癌細胞生長抑制。采用肝癌細胞系和裸鼠模型，Liuet等（2008）研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽通過抑制Rac1依賴通路，降低細胞能動性和遷移性從而抑制腫瘤細胞的新陳代謝。這些研究結果說明，蜂毒肽也可以被用作化療試劑抵來抗體內腫瘤。盡管蜂毒肽對裸鼠肝癌細胞系表現(xiàn)出抑制作用，但給予體內高劑量的蜂毒肽會產生副作用，尤其是肝損傷和溶血作用。因此，考慮到慢性肝損傷和肝功能損傷時肝癌細胞總會進化，蜂毒肽的臨床應用需要謹慎。當然，可以通過對蜂毒肽鏈的修飾來避免或減少蜂毒肽引起的副作用。Zhao等（2006）通過對蜂毒肽中Val 5到Arg、Ala 15到Arg的突變以及Leu 15的缺失，顯著降低了其副作用（溶血作用），但仍保留其抗菌活性。這可以成為一種可能解決方法使蜂毒肽的臨床應用變得安全，同時又能保持其體內效能。

4.結語

蜂毒及其主要成分蜂毒肽對不同種類的癌細胞，如腎、肺、肝、前列腺、膀胱、胸和白血病細胞中都有很強的毒性作用。因此，蜂毒肽在腫瘤治療領域的應用前景十分廣闊。

蜂毒和蜂毒肽的作用機理是與PLA2、半胱天冬酶和基質金屬蛋白酶破壞腫瘤細胞的活性相關的。蜂毒肽和荷爾蒙受體的結合與蜂毒肽基因治療可能對一些腫瘤，如乳腺腫瘤和前列腺腫瘤的治療有用。Ling等（2005）報道攜帶蜂毒肽基因的重組病毒在肝癌細胞，包括體外和體內的抑制作用，顯示動物毒性基因可以被用于抗腫瘤試劑。與蜂毒肽相比，編碼蜂毒肽的基因序列比較短（78bp），對于特定目標治療，其合成和轉染會相對較容易。因此，蜂毒肽作為兩性蛋白可以在腫瘤治療中扮演重要角色。蜂毒肽在抵抗表達高水平的Ras致癌基因培養(yǎng)基細胞中的活性更強。此外，蜂毒肽增加了PLA2在Ras致癌基因轉化細胞的活性，導致了它們的選擇性毀滅，而且這種通過蜂毒肽的PLA2超活化作用，可以成為蜂毒肽抗腫瘤細胞的一個重要途徑。

蜂毒肽的裂解屬性是一個很有吸引力的抗癌特性。盡管對腫瘤細胞有廣泛的細胞毒性，蜂毒肽也會對正常細胞產生毒性，在臨床應用之前，需要對蜂毒肽的注射途徑、具體劑量及對正常細胞可能的副作用做更多的研究。并且，蜂毒肽的藥理作用如果沒有合適的傳遞物質就難以實現(xiàn)。這一方面可以通過靜脈注射擁有能夠安全傳遞大量蜂毒肽的蜂毒肽納米顆粒加以克服；另一方面，可以用現(xiàn)有的化療藥物與蜂毒肽藥物相結合，可以在化療過程中使標準化療藥物的濃度降至最低。