杜晶晶， 孫軼華

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是普遍存在于生物體中的一種序列特異性的基因表達(dá)調(diào)控方式，它是由小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)介導(dǎo)的特異性降解mRNA的過程[1]。T淋巴細(xì)胞是處于非分裂期的細(xì)胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要作用，是基因治療中常用的靶細(xì)胞。但在RNAi技術(shù)中，T淋巴細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低而影響了其應(yīng)用。因此，提高目的基因?qū)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對于這類疾的基因治療具有重要意義[2]。現(xiàn)將慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在T淋巴細(xì)胞研究中的方法和應(yīng)用作一綜述。

1 RNA干擾的載體

RNA干擾的應(yīng)用主要包括：(1)siRNA的設(shè)計與制備；(2)siRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)RNA干擾效能的檢測。將siRNA對應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子，這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA，能達(dá)到較長時間的基因沉默；直接轉(zhuǎn)導(dǎo)合成的siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能夠特異性抑制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，但siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解且RNAi效應(yīng)持續(xù)時間短[3]。針對這些情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)，但是，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的效率不如病毒載體，且不能轉(zhuǎn)染非分裂相細(xì)胞。慢病毒載體是常用的病毒載體之一，它是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。其特點(diǎn)為免疫原性低， 能感染分裂相和非分裂相細(xì)胞，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)入甚至無法轉(zhuǎn)入的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞等未分化細(xì)胞，通過慢病毒介導(dǎo)的方法能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合，是實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞siRNA穩(wěn)定表達(dá)的理想工具[4]。

2 慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾的作用機(jī)制

慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾的表達(dá)載體有兩類：一類分別轉(zhuǎn)錄有義RNA和反義RNA，兩條鏈在細(xì)胞內(nèi)互補(bǔ)結(jié)合生成siRNA；另一類則轉(zhuǎn)錄短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)。其中，shRNA更加常用，其結(jié)構(gòu)主要由慢病毒載體骨架和shRNA表達(dá)框組成。shRNA表達(dá)框主要包括：RNA聚合酶III(RNA polymerase III，Pol III)依賴的啟動子、shRNA結(jié)構(gòu)序列以及終止子。其中，shRNA結(jié)構(gòu)序列由兩段互補(bǔ)序列相向組成，兩段序列之間有4～10個堿基的中間序列。慢病毒感染細(xì)胞后，將此shRNA表達(dá)框整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。shRNA在宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄后，兩段互補(bǔ)序列堿基配對結(jié)合，中間序列則成為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)可被Dicer酶識別并切除，產(chǎn)生的siRNA將執(zhí)行RNA干擾[4]。

小RNA是一類新發(fā)現(xiàn)的長度為21～25個核苷酸的小分子RNA,它普遍存在于多細(xì)胞生物中，是調(diào)控RNA的重要分子,根據(jù)小RNA的結(jié)構(gòu)和功能大概可分為3類：siRNA、微RNA(microRNAs, miRNAs)和其它小RNA[5]。它的體外制備方式主要有3種：化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄及用RNase III 或Dicer酶消化長片段雙鏈RNA制備siRNA。化學(xué)合成法最為昂貴，適用于已經(jīng)找到最有效的siRNA的前提下，需要大量siRNA進(jìn)行研究時使用；體外轉(zhuǎn)錄法則用于篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs且經(jīng)費(fèi)不十分充裕時。雖然化學(xué)合成的siRNA可以不經(jīng)過任何細(xì)胞修飾而直接并入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)發(fā)揮作用，但是依賴Dicer酶產(chǎn)生的siRNA通常比之更有效[6]。shRNA從正義和反義的DNA序列轉(zhuǎn)錄之后產(chǎn)生長度為19～29的核苷酸片段，中間由一莖環(huán)序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)[7]。因此，shRNA的一個優(yōu)勢就是它的莖環(huán)式二級結(jié)構(gòu)是依賴Dicer酶途徑產(chǎn)生的siRNA[8]；另一個優(yōu)勢是從DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定表達(dá)，另外，長度較短的shRNA也最大限度減少了哺乳動物雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R(PKR)的潛在活化[9-10]，從而限制了廣泛存在的脫靶效應(yīng)。當(dāng)然，shRNA也可能通過模擬miRNA從而引起廣泛的脫靶效應(yīng)[11]。

3 慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在干擾T淋巴細(xì)胞功能中的研究策略

慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在靜息細(xì)胞或活化的難轉(zhuǎn)染細(xì)胞均能實現(xiàn)基因的高效轉(zhuǎn)移，包括沉默T淋巴細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)[12]，尤其在CD4+T淋巴細(xì)胞，一些基因表達(dá)的沉默對于HIV-1復(fù)制具有明顯抑制作用，因此，這種技術(shù)對于研究T淋巴細(xì)胞的一些潛在功能意義重大。該技術(shù)的基本應(yīng)用過程包括：設(shè)計和克隆一個shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)移載體；三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并濃縮病毒獲得高滴度的病毒顆粒；獲得病毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞系[13]；驗證在該細(xì)胞系中目的基因的沉默程度。然而，由于各種原因?qū)е掳衜RNA的不完全沉默以及實驗控制的不嚴(yán)格對翻譯水平的影響，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在人類細(xì)胞基因功能分析中的應(yīng)用在一定程度上受到限制，這些限制主要表現(xiàn)在后2步：能否成功獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞系和能否嚴(yán)格驗證RNA干擾程度，以下將重點(diǎn)介紹與此相關(guān)的研究策略。

3.1提高慢病毒對T淋巴細(xì)胞的感染效率 采用濃縮好的慢病毒顆粒感染T淋巴細(xì)胞首先需要確定病毒感染細(xì)胞的最適比例，即感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。在采用慢病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)研究整合素對T淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的相關(guān)分子通路時發(fā)現(xiàn),通常MOI值為50時比較合適，同時規(guī)范貯存用于實驗的慢病毒顆粒對確保高效感染至關(guān)重要，在解凍后感染前慢病毒應(yīng)始終置于冰上，盡量避免反復(fù)凍融慢病毒以確保每次感染細(xì)胞時的慢病毒MOI值相差不大。 在使用濃縮好的慢病毒顆粒感染T淋巴細(xì)胞時需要提前活化靶細(xì)胞，可使用植物血凝素促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，并且在慢病毒感染細(xì)胞的過程中添加白細(xì)胞介素-2以維持T淋巴細(xì)胞的長期培養(yǎng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)目前使用Amaxa公司的核轉(zhuǎn)染技術(shù)感染靜息T淋巴細(xì)胞，是一種有效的方式，但轉(zhuǎn)入的基因表達(dá)時間短暫[14-15]。

Polybrene是為了促進(jìn)慢病毒感染靶細(xì)胞而常用的一種試劑，它可以增強(qiáng)病毒和宿主間的疏水作用，從而增加感染率[16]。離心感染病毒法是慢病毒感染T淋巴細(xì)胞過程中的重要步驟，可以很大程度上增加懸浮細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)的感染率[14]。但是，在研究HIV-1病毒時發(fā)現(xiàn)，離心介導(dǎo)的增強(qiáng)HIV-1病毒進(jìn)入細(xì)胞不是通過增加細(xì)胞與病毒的接觸概率而發(fā)揮作用，相反，該過程伴有離心介導(dǎo)的肌動蛋白和絲切蛋白活化，從而增強(qiáng)病毒綁定、進(jìn)入、DNA整合和核轉(zhuǎn)移。因此，當(dāng)采用離心法提高慢病毒對靶細(xì)胞的感染率時應(yīng)結(jié)合具體實驗?zāi)康闹?jǐn)慎分析數(shù)據(jù)結(jié)果[17-18]。

3.2避免脫靶效應(yīng)RNA干擾程度主要通過RT-PCR和Westernblotting在mRNA和蛋白水平檢測，但由于二者都是RISC組分，故功能界限并不清晰，且在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊，因此，在蛋白水平和mRNA水平同時證明表達(dá)降低才是傳統(tǒng)意義的RNA干擾。如果只是蛋白水平降低，這很可能只是microRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制參與其中[19]。

由于非目標(biāo)效應(yīng)的存在，采取適當(dāng)?shù)目刂拼胧τ讷@得準(zhǔn)確的RNA干擾實驗結(jié)果非常重要，一個共同的金標(biāo)準(zhǔn)是靶蛋白的再表達(dá)和沉默前表型獲救[20]。Miest等[21]曾使用γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(gamma-retroviralvectors,MLV)驗證靶蛋白的再表達(dá)情況，Llano等則采用穩(wěn)定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)同樣達(dá)到了目的[22]。當(dāng)需要siRNA較多時，這種控制尤其重要，甚至需要定量檢測蛋白水平的改變，從而精確估計沉默的程度。另外，當(dāng)設(shè)計了針對mRNA不同區(qū)域的多條siRNA，并且證明了它們具有相似的干擾效果時[23]，可以不需要驗證靶蛋白的再表達(dá)，RNA干擾的結(jié)果已經(jīng)足夠令人信服。當(dāng)然，如果是進(jìn)行大規(guī)模的基因掃描時，控制手段必須更加簡化[19]。

為了克服這些缺陷，有人建立了一種單一慢病毒載體，它能夠在同一種細(xì)胞中兼顧消耗內(nèi)源性基因表達(dá)和表達(dá)抗原標(biāo)記的抗靶基因siRNA。在人類T淋巴細(xì)胞，沉默α肌動蛋白1(RNAi-depletedα-actinin-1)會抑制基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)的趨化性，但是，當(dāng)同時在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)抵抗RNAi-α-ACTN1(RNAi-resistantα-ACTN1 ，rr-α-ACTN1)時，SDF-1的趨化功能可以被挽救。通過GFP標(biāo)記rr-α-ACTN1可以檢測到rr-α-ACTN1的亞細(xì)胞定位，這一系統(tǒng)不僅提供了對于RNAi內(nèi)部非目標(biāo)效應(yīng)的控制，同時也是潛在的快速分析基因結(jié)構(gòu)功能和基因治療的工具[24]。

4 慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在T淋巴細(xì)胞研究中的應(yīng)用

現(xiàn)在越來越多的研究人員開始采用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)來研究生物體的基因表達(dá)。該技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能基因組學(xué)、藥物靶點(diǎn)篩選、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析、疾病治療等。

4.1研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對這些新基因功能的研究。近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxicT-lymphocyteantigen4, CTLA4)基因是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)中的一種重要基因，它與許多自身免疫性疾病有關(guān)，尤其是Ⅰ型糖尿病。通過慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立小鼠RNAi模型，研究CTLA4自然變異帶來的影響時發(fā)現(xiàn)，不同于相應(yīng)的基因敲除小鼠多器官自身免疫表型，CTLA4表達(dá)減少導(dǎo)致的自身免疫性疾病優(yōu)先集中在胰腺，隨后迅速發(fā)展為糖尿病。這揭示了一種潛藏于CTLA4基因缺乏小鼠的淋巴組織增生和多器官自身免疫的特異性，而且容易被忽略，因此慢病毒介導(dǎo)的shRNA與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，更容易發(fā)現(xiàn)與CTLA4表達(dá)變異相關(guān)的人類疾病[25]。

4.2研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新途徑 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不同基因的上，下游關(guān)系。在炎癥和免疫反應(yīng)過程中，整合素對T淋巴細(xì)胞的黏附和遷移發(fā)揮重要作用，為了解T淋巴細(xì)胞中整合素發(fā)揮作用的具體分子通路，Banerjee等[14]用到了慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，從而有效地研究各個方面整合素的功能，甚至執(zhí)行全基因組RNA干擾掃描以全面尋找到T淋巴細(xì)胞整合素功能的調(diào)節(jié)者。

4.3開展基因治療的新策略HIV-1的靶細(xì)胞有CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、星狀細(xì)胞等，其中主要是CD4+T細(xì)胞，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾作為一種探索基因功能的有力工具，已廣泛應(yīng)用于抗艾滋病研究[26-27]。傳統(tǒng)的抗艾滋病藥物主要針對病毒酶發(fā)揮作用因而常受到抗藥性的限制，最近發(fā)現(xiàn)可以采用艾滋病毒依賴因子，或病毒復(fù)制依賴的宿主蛋白為靶點(diǎn)研制藥物。研究證實Tat-SF1作為一種艾滋病毒依賴因子存在于SupT細(xì)胞(在許多HIV患者血清中出現(xiàn)的源于CD4+T細(xì)胞系并與自身抗體反應(yīng)的細(xì)胞)中，但是它并不是病毒復(fù)制最重要的輔助因子且受到抑制時會影響細(xì)胞生長，從而表明了檢測HIV-1在持續(xù)抑制宿主防御因子表達(dá)的細(xì)胞中的復(fù)制動態(tài)及細(xì)胞毒性的重要性，繼而使它有望作為艾滋病的潛在治療靶點(diǎn)[28-29]。

許多組織移植需要組織相容性匹配的人類白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen,HLA)以預(yù)防移植排斥、降低免疫抑制水平而維持移植物存活時間、減少移植物抗宿主病的風(fēng)險，尤其是對于骨髓移植更加重要。然而，近期的研究表明利用基因轉(zhuǎn)移和基因調(diào)控技術(shù)可能開辟HLA表達(dá)水平降低的移植工程。當(dāng)采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默HLA一類及等位基因時可以實現(xiàn)HLA在人類細(xì)胞表面高效且劑量依賴性減少，并伴有對同種反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抵抗作用，同時避免主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)被非限制性殺死[30]。

5 總結(jié)

慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾應(yīng)用于基因治療是該技術(shù)發(fā)展的一個大方向。盡管可以采取多種方式控制慢病毒載體轉(zhuǎn)染過程及避免脫靶效應(yīng)，但由于T淋巴細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞且懸浮生長，這些條件都決定了它是一種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因此，提高目的基因?qū)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要，這也預(yù)示著距離該技術(shù)大規(guī)模臨床應(yīng)用還有很長的路要走。但是，隨著慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾機(jī)制的進(jìn)一步揭示，RNA干擾技術(shù)在T淋巴細(xì)胞功能研究和臨床治療藥物研究中的應(yīng)用必將具有更廣闊的前景。

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