李芳芳，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

綜述與專論

豚鼠遺傳檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李芳芳，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

豚鼠作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的各個(gè)領(lǐng)域,其遺傳質(zhì)量的穩(wěn)定性直接影響著它的發(fā)展和應(yīng)用。遺傳檢測(cè)目的是為了證實(shí)各品系動(dòng)物應(yīng)具有的遺傳特性，檢查是否發(fā)生遺傳污染和遺傳突變等，確保被檢對(duì)象符合該品系的要求。生化標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為實(shí)驗(yàn)豚鼠基因純合度、遺傳類型檢測(cè)、遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供了更為簡(jiǎn)便可靠的研究手段。本文就生化標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記在豚鼠多樣性研究中的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行了論述，為豚鼠遺傳檢測(cè)方法的建立提供幫助。

豚鼠；遺傳檢測(cè)；分子遺傳標(biāo)記；

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為生命科學(xué)研究中重要的實(shí)驗(yàn)材料，其遺傳背景對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響至關(guān)重要，生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)要想得到可靠的可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須使用遺傳特性穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

豚鼠作為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有特殊的生物學(xué)特性和生理解剖特點(diǎn)。目前，在速發(fā)型過(guò)敏性呼吸道疾病的研究，實(shí)驗(yàn)性壞血病的研究，各種抗結(jié)核病藥物的篩選，聽(tīng)覺(jué)和內(nèi)耳疾病的研究等方面都是最佳選擇[1]。國(guó)內(nèi)使用的豚鼠多為短毛的英國(guó)種豚鼠，屬于封閉群，遺傳結(jié)構(gòu)呈雜合性，遺傳背景不明確，需要進(jìn)行定期的遺傳檢測(cè)。本文就生化標(biāo)記技術(shù)，細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)及分子標(biāo)記技術(shù)在豚鼠多樣性研究中的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 豚鼠遺傳檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

遺傳檢測(cè)是通過(guò)形態(tài)學(xué)，免疫學(xué)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法來(lái)測(cè)定動(dòng)物品系的遺傳組成是否發(fā)生變化[2]，是遺傳監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容之一。遺傳標(biāo)記是指在遺傳分析上用作標(biāo)記的基因，也稱標(biāo)記基因。自從19世紀(jì)中期，形態(tài)學(xué)標(biāo)記被首次應(yīng)用以后，遺傳標(biāo)記就得到了廣泛的應(yīng)用。以外部特征為主的形態(tài)標(biāo)記，以染色體的帶型和核型為主的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，以生物體內(nèi)生化性狀為主的生物化學(xué)標(biāo)記，以免疫學(xué)特征為主的免疫學(xué)標(biāo)記和以核苷酸序列變異為主的分子標(biāo)記都屬于遺傳標(biāo)記。生化標(biāo)記在豚鼠遺傳檢測(cè)中比較常用，分子標(biāo)記在豚鼠遺傳檢測(cè)中處于發(fā)展階段。本文主要講述細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，生化標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)在豚鼠遺傳檢測(cè)中的應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)。

1.1 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要指染色體的帶型和核型分析。染色體作為遺傳物質(zhì)的載體, 其變異必然會(huì)導(dǎo)致生物體發(fā)生遺傳變異。染色體數(shù)目的變異( 整倍性或非整倍性) 和染色體結(jié)構(gòu)的變異( 缺失、易位、倒位、重復(fù)等)是染色體的主要變異 , 染色體的形態(tài)(著絲點(diǎn)位置)、縊痕和隨體等核型特征也是多樣性的來(lái)源[3]。

經(jīng)過(guò)特殊處理染色體會(huì)出現(xiàn)不同的帶型，C帶和G帶是常見(jiàn)的染色體帶型。胡根林等[4]觀察了浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心培育的Zmu-1:DHP豚鼠染色體的G帶、C帶及銀染核仁組織者，結(jié)果表明核仁組織者的數(shù)目和位置均較恒定, G帶與其他豚鼠有差異,C帶則與其他哺乳動(dòng)物相似, 說(shuō)明Zmu-1:DHP豚鼠在染色體核型上已發(fā)生變異。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直觀、穩(wěn)定，為動(dòng)物的遺傳檢測(cè)提供了較好的方法，但標(biāo)記數(shù)目有限，多態(tài)性差等不足之處使其發(fā)展受限。

1.2 生化標(biāo)記

生化標(biāo)記是以生物的某些生化特征作為遺傳標(biāo)記，主要指異構(gòu)蛋白標(biāo)記和同工酶標(biāo)記等。利用生化標(biāo)記研究豚鼠生化基因位點(diǎn)多態(tài)性這種方法始于1971年，根據(jù)同工酶的多態(tài)性來(lái)鑒定和區(qū)別動(dòng)物品系，達(dá)到遺傳檢測(cè)的目的。

1986年，Casikl[5]檢測(cè)了7個(gè)豚鼠品系共20種同工酶和蛋白質(zhì)的多態(tài)性，日本的淺野敏彥等檢測(cè)了13個(gè)豚鼠品系的7種生化標(biāo)記的多態(tài)性，兩人共闡明了10種同工酶和蛋白質(zhì)具有多態(tài)性現(xiàn)象，初步建立了豚鼠遺傳概貌圖[6]。國(guó)內(nèi)，劉迪文等采用生化電泳法測(cè)定了Zmu-1：DHP育成品系豚鼠和該品系親本DHP豚鼠的14個(gè)同工酶的遺傳標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。傅軍[7]對(duì)Hartley品系豚鼠和Zmu-1：DHP品系豚鼠的血清蛋白進(jìn)行了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定，結(jié)果顯示Zmu-1:DHP 豚鼠的血清蛋白可分辨出21 條蛋白條帶，而Hartley 品系豚鼠有20 條蛋白條帶，這表明兩品系豚鼠血清蛋白組成上有差異。蔡月琴等[8]比較分析白毛黑眼(WHBE) 豚鼠、花色豚鼠和DHP 豚鼠三個(gè)品系豚鼠在13 個(gè)血液蛋白位點(diǎn)上的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tf1、Ptf、Tf2、Est1 和Es 在三個(gè)豚鼠品系中表現(xiàn)為多態(tài)，其中Tf1 可作為識(shí)別WHBE 豚鼠的遺傳標(biāo)記。

生化標(biāo)記與細(xì)胞遺傳學(xué)特征相比分析簡(jiǎn)單快速、數(shù)量上更豐富。不足之處是檢測(cè)的位點(diǎn)局限，大多是單基因遺傳的位點(diǎn)，不能反映動(dòng)物的整個(gè)的遺傳概貌，并且其結(jié)果不易判讀。

1.3 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是近年來(lái)現(xiàn)代遺傳標(biāo)記學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，它以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列的變異為基礎(chǔ)。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)等是在豚鼠遺傳檢測(cè)中可以使用的分子遺傳標(biāo)記，本文針對(duì)這些方法目前的研究現(xiàn)狀及存在的問(wèn)題探討了今后的研究趨向和發(fā)展。

1.3.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：RFLP始于20世紀(jì)80年代初，以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)。RFLP技術(shù)是一種高效的基因組DNA多態(tài)性分析技術(shù)，不同基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，檢測(cè)含同源序列的酶切片段長(zhǎng)度的差異。作為發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，它主要用于遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位等，在遺傳分析中得到了廣泛的應(yīng)用。曹宏卿等[9]通過(guò)12種限制性內(nèi)切酶酶切，運(yùn)用mtDNA的RFLP標(biāo)記分析了FMMU白化豚鼠和花色豚鼠的遺傳多樣性，結(jié)果表明FMMU白化豚鼠區(qū)別于花色豚鼠的生物學(xué)特性和mtDNA不相關(guān)。

RFLP技術(shù)多態(tài)性高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，是群體遺傳變異分析強(qiáng)有力的工具，但由于操作繁瑣，信息含量低，需要樣本量大等不足，使該方法的應(yīng)用受到了很大的限制。

1.3.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA：RAPD分子標(biāo)記技術(shù)利用10 bp左右的隨機(jī)引物對(duì)生物基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，是以PCR擴(kuò)增技術(shù)為核心發(fā)展起來(lái)的。RAPD-PCR可用于分析同一群體的不同個(gè)體之間和同一物種的不同群體之間的遺傳相關(guān)性和變異性[10]。最初由Williams和Welsh實(shí)驗(yàn)室[11-12]發(fā)展而來(lái)，被廣泛應(yīng)用于個(gè)體和品系鑒定、基因定位、遺傳多樣性檢測(cè)、遺傳圖譜的構(gòu)建等研究中。

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在豚鼠遺傳多樣性研究中應(yīng)用相對(duì)較少，但也不乏一些研究值得借鑒。劉迪文，郭漢身[13]采用RAPD方法，用40條隨機(jī)引物，對(duì)10只Zmu-1:DHP豚鼠和12只對(duì)照的DHP豚鼠DNA樣品，進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果其中有3條引物的擴(kuò)增條帶存在多態(tài)性，多態(tài)現(xiàn)象主要表現(xiàn)為DNA序列長(zhǎng)度呈多態(tài)性引起的擴(kuò)增帶位置差異。

近年，國(guó)內(nèi)外利用RAPD技術(shù)在一些動(dòng)物、植物、微生物種群分析和遺傳作圖等方面取得了重要進(jìn)展[14-17]。RAPD標(biāo)記靈敏度高，多態(tài)性強(qiáng)，可用于不同生物基因組多態(tài)性的研究。90年代前期RAPD技術(shù)被廣泛應(yīng)用，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)也有不足的一面，比如它檢測(cè)的變異來(lái)源不清，受實(shí)驗(yàn)條件的影響較大，不能區(qū)分雜合子和純合子。

1.3.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性：AFLP標(biāo)記技術(shù)是一種對(duì)未知區(qū)域多態(tài)性進(jìn)行全基因組掃描的技術(shù)，是由Zabean[18]和Vos[19]兩位科學(xué)家發(fā)展起來(lái)的。AFLP技術(shù)的原理如下：首先將DNA用內(nèi)切酶酶解，接上接頭，設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可產(chǎn)生數(shù)量豐富的帶型標(biāo)記，分辨率高。

自Vos等1995 年創(chuàng)立至今, 已有大約5 500篇關(guān)于AFLP標(biāo)記的外文文獻(xiàn), 在植物等領(lǐng)域中的應(yīng)用已極為成熟。盡管近年來(lái)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用AFLP標(biāo)記的文獻(xiàn)日益增多，但以病原微生物的分類與鑒定等方面為主[20-23],應(yīng)用于疾病相關(guān)的分子標(biāo)記篩選的文獻(xiàn)相對(duì)較少。陶愛(ài)林等[24]在建立豚鼠聽(tīng)力衰退模型基礎(chǔ)上，結(jié)合D-半乳糖致衰及噪音的刺激，應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，采用混合極端類型方法，對(duì)模型中的極端個(gè)體進(jìn)行全基因組掃描，以獲取包括核基因組水平上的分子標(biāo)記，為AHL(老年聽(tīng)力衰退)分子機(jī)制研究提供新的切入點(diǎn)。結(jié)果表明14對(duì)選擇性擴(kuò)增引物僅擴(kuò)增到一個(gè)能將兩類極端表型絕然分別開(kāi)來(lái)的多態(tài)性條帶。

AFLP標(biāo)記具有多態(tài)性檢出率高、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)。但該標(biāo)記無(wú)法準(zhǔn)確鑒定雜合子，費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)使其發(fā)展受到了阻礙。

1.3.4 微衛(wèi)星DNA：微衛(wèi)星DNA是指一些簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)序列，因?yàn)槠渲貜?fù)單位比小衛(wèi)星的短, 故被稱為微衛(wèi)星( microsatellite)，是指以幾個(gè)核苷酸( 一般為1～6 個(gè)) 多次重復(fù)組成的串聯(lián)序列。由于其高度可變區(qū)核心序列重復(fù)數(shù)目的不同，產(chǎn)生了DNA多態(tài)性[25]，又被稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)( simple sequence repeats，SSR)，長(zhǎng)度多在100 bp以內(nèi)。

大鼠、沙鼠、小鼠、家兔、和豬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微衛(wèi)星標(biāo)記都有專門的報(bào)導(dǎo)并被應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性評(píng)估、標(biāo)記輔助選擇和遺傳監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，推動(dòng)了人類疾病動(dòng)物模型的建立、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的保持和新品系的培育、功能基因定位和克隆等研究工作的進(jìn)步[26-31]。由于豚鼠在遺傳背景上與大小鼠、家兔等物種差別較大[32-33]，故無(wú)法借鑒這些物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。

獲取豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的常用方法有磁珠富集法和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法。近年來(lái)磁珠富集法被廣泛用于微衛(wèi)星篩選研究中[34-36]，它具有陽(yáng)性克隆率高、篩選效率高等優(yōu)點(diǎn)[37]。1998年浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心豚鼠繁殖中心引進(jìn)了Dunkin Hartley 豚鼠封閉群，至今已形成1 000個(gè)個(gè)體的種群。中心研究人員通過(guò)磁珠富集法篩選獲得了17對(duì)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)[38]。朱亮等[1]檢測(cè)我國(guó)現(xiàn)有的Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景，利用8個(gè)多態(tài)性好的微衛(wèi)星標(biāo)記，初步確定了豚鼠群體的遺傳概貌，為豚鼠封閉群遺傳監(jiān)測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)。劉迪文，楊偉偉等利用磁珠富集法和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法獲取豚鼠微衛(wèi)星序列，共獲得26個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，45個(gè)潛在的候選標(biāo)記，為微衛(wèi)星標(biāo)記在豚鼠遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)及突變基因定位等工作的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。今后仍需選擇更多的微衛(wèi)星位點(diǎn)來(lái)分析更多的品系，加強(qiáng)微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇和檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化研究。

微衛(wèi)星標(biāo)記在基因組中分布廣泛, 多態(tài)性高，按孟德?tīng)栠z傳規(guī)律遺傳[39]，操作簡(jiǎn)便,信息量大，是理想的分析變異的標(biāo)記之一，但篩選和檢測(cè)微衛(wèi)星DNA的過(guò)程復(fù)雜，這給微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用帶來(lái)困難。

1.3.5 單核苷酸多態(tài)性：SNP是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸位置上存在顛換、置換、缺失和插入等變異所引起的序列多態(tài)性，并且任一種等位基因在群體中頻率大于等于百分之一，是一種二等位基因標(biāo)記[40]。

SNP是人類基因組中最常見(jiàn)的變異形式，是藥物反應(yīng)和疾病易感性的決定因素[41]。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，具有代表性、密度高、，遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn)，能夠全面反映基因組遺傳變異情況[42]。

近年來(lái)，SNP技術(shù)被用于近交系小鼠的遺傳質(zhì)量檢測(cè)，并且建立了近交系小鼠的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)[43]。目前，SNP標(biāo)記用于豚鼠遺傳檢測(cè)的報(bào)道甚少，Oostendorp J[44]等克隆了遠(yuǎn)交Dukin Hartley豚鼠的β2-腎上腺素受體基因，并在該基因的編碼區(qū)中篩選出5個(gè)簡(jiǎn)并SNP，它們與人β2-腎上腺素受體編碼區(qū)的多態(tài)性沒(méi)有顯示出任何相似性。作為第三代遺傳標(biāo)記, 隨著技術(shù)的發(fā)展,SNP 的應(yīng)用潛力將會(huì)不斷的發(fā)掘和體現(xiàn)。

2 結(jié)語(yǔ)

遺傳檢測(cè)的最終目的都是要揭示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳背景，確保被檢測(cè)對(duì)象符合相應(yīng)的要求。作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，豚鼠的特征十分顯著，但其分子標(biāo)記的數(shù)量尚不能滿足需要，遺傳檢測(cè)還處于探索階段，所以國(guó)內(nèi)豚鼠的遺傳背景和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步完善。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記必將不斷改進(jìn)完善，更多更有效快捷的分子標(biāo)記技術(shù)將會(huì)應(yīng)用于豚鼠的遺傳檢測(cè)中。在DNA分子標(biāo)記技術(shù)的日益成熟和不同檢測(cè)方法的聯(lián)合使用下，豚鼠的遺傳背景將會(huì)有更深入的研究。

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Research progress of genetic monitoring methods in guinea pig

LI Fang-fang, YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Guinea pig as a commonly used laboratory animal is widely used in various fields of biomedical research. The stability of genetic quality directly affects its development and application. Genetic testing is designed to confirm the genetic characteristics of each strain, to verify whether there are genetic mutations and other genetic contamination, to ensure that the test object meets the requirements of this strain. Along with the emerge of biochemical and molecular marker technology, a more convenient and reliable means is provided for research of genetic homozygosity, genetic type detection and genetic quality monitoring of guinea pigs. In this paper, the application and research progress of biochemical, cytological and molecular markers in studies of guinea pig diversity will be summarized, and provide some help for genetic testing guinea pig.

Guinea pig; Genetic testing; Molecular genetic markers.

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAK11B01)。

李芳芳(1988-)，女，碩士生，主要研究方向：分子遺傳學(xué)，Email: lifangfang0601@163.com。

岳秉飛(1960-)，男，研究員，主要研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)，Email: yue-bingfei@org.cn。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0062-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.014

2014-05-06