楊偉莉，涂著池，李曉江

(中國科學院遺傳與發(fā)育學生物學研究所，北京 100101)

綜述與專論

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)：構(gòu)建非人靈長類動物疾病模型的新技術

楊偉莉，涂著池，李曉江

(中國科學院遺傳與發(fā)育學生物學研究所，北京 100101)

動物疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關鍵作用。非人靈長類動物由于與人類更為接近，在探究人類神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)精神疾病及人類認知功能、神經(jīng)環(huán)路等方面具有巨大的優(yōu)勢可成為研究和藥物篩選的重要疾病模型。然而，由于缺乏大動物的胚胎干細胞系，傳統(tǒng)的基因打靶技術難于用來建立靈長類動物疾病模型。最近發(fā)展的基因編輯新技術CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定向?qū)蜻M行修飾上展現(xiàn)出了巨大的潛力。本文將介紹CRISPR/Cas9技術的發(fā)展和應用，以及非靈長類動物作為神經(jīng)退行性疾病模型的優(yōu)勢和意義。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)；非人靈長類動物；神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著年齡老化而惡化，導致功能障礙，如肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、額顳葉癡呆、老年性癡呆阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森癥等。隨著人類生活水平的提高與壽命的延長，老年人比例不斷增加，神經(jīng)退行性疾病逐漸增多，也越來越受到社會的關注。然而，該類疾病大多發(fā)病機制尚不明確，無有效的治療措施。因此，要篩選和檢測出有效的藥物和治療方法，成功建立出能夠模擬出人類神經(jīng)退行性疾病癥狀的有效動物模型成為關鍵。非人靈長類動物和人類在遺傳學基礎上和生理病理上高度相似，被公認為是理想的疾病研究動物模型?；蚪M編輯技術在疾病模型建立過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是最新發(fā)現(xiàn)的CRISPER/cas9技術因簡單、方便且能夠精確的對基因進行修飾，使得用CRISPER/cas9技術建立基因修飾猴來模擬人類重大疾病成為可能。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

建立動物模型的基因編輯方法主要有轉(zhuǎn)基因和基因打靶。轉(zhuǎn)基因即用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能夠穩(wěn)定傳給下一代。動物轉(zhuǎn)基因技術的操作方法主要有顯微注射法，胚胎干細胞法和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法等。轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展在生物醫(yī)學研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了相當重要的作用。而基因打靶技術是指通過內(nèi)源性DNA定點重組，改變基因組中的某一特定基因從而在生物活體內(nèi)研究該基因的功能，包括基因敲除和敲入[1]。傳統(tǒng)的基因打靶技術依賴于胚胎干細胞系，首先在胚胎干細胞系中進行基因打靶，然后移植打靶后的胚胎干細胞入動物母體，讓其發(fā)育成帶有突變基因的動物。由于缺乏大動物的胚胎干細胞系，此傳統(tǒng)的基因打靶技術難于用來建立靈長類動物疾病模型。最近發(fā)展的定向基因組編輯方法CRISPR/Cas9技術能在胚胎細胞中直接打靶，已廣泛用于不同種屬中來進行基因組改造和基因修飾。

CRISPR/Cas9是一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導Cas蛋白對基因進行編輯和修飾的新技術。早在1987年，日本大阪大學(Osaka University)在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)域附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段由簡單的重復序列組成，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有序列，并在2002年正式命名為CRISPR序列[2]。CRISPR，或稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一個特殊的DNA重復序列家族，廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復結(jié)構(gòu)[2, 3]。CRISPR 位點通常由高度保守的短重復序列(repeats)組成, 重復序列之間被間隔序列(spacer)隔開。在CRISPR位點附近，存在一系列CRISPR相關(CRISPR-associated, Cas)基因，如圖1[29]。研究表明，CRISPR與一系列相關蛋白、前導序列一起構(gòu)成一套保守且完整的系統(tǒng)，為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力[4]。

圖1 CRISPR位點結(jié)構(gòu)[29]Fig.1 The struscture of CRISPR System[29]

圖2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的模式圖[7]Fig.2 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break[7]

CRISPR/Cas9作為細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。即：當噬菌體入侵細菌時，Cas蛋白復合物靶向并裂解噬菌體基因組中短的原型間隔序列(proto-spacer)，該序列是與CRISPR 間隔序列同源的噬菌體基因序列，然后這些原型間隔序列整合到CRISPR 位點的5′端[5]，隨后這些間隔序列被轉(zhuǎn)錄成crRNAs(CRISPR RNAs)，當噬菌體再次被噬菌體感染時, crRNAs作為模板靶向噬菌體的原型間隔序列并利用cas蛋白進行切割，從而對抗外源基因的入侵[6]。Jinek等對CRISPR/ Cas9系統(tǒng)進行改造,將crRNA和tracrRNA2個序列通過一個四堿基的連接環(huán)連接起來,構(gòu)成一個新的向?qū)NA,相對于野生型的CRISPR/ Cas9系統(tǒng)(如圖2)[7]，這種新型的系統(tǒng)更加容易構(gòu)建并具有相同的打靶效率[7]。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導下對特定位點的DNA進行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制或者非同源末端連接機制對斷裂的DNA進行修復。若細胞通過同源重組機制進行修復，會用另外一段DNA片段填補斷裂的DNA缺口，因而會引入一段“新的”遺傳信息。最近多項研究都表明，RNA介導的Cas9系統(tǒng)能夠成功介導細菌、小鼠細胞、斑馬魚胚胎、人類細胞、植物細胞、非人靈長類動物食蟹猴胚胎等的基因組編輯[7-13](圖3)[7-13,17]。Rudolf Jaenisch等利用該技術成功構(gòu)建了同時攜帶多個基因突變的小鼠[14]。中科院李勁松研究組設計出一種引導Cas9結(jié)合到一個發(fā)生單堿基突變的等位基因上的向?qū)NA，在這種等位基因上，Cas9能夠切割發(fā)生突變的DNA序列。他們將野生型等位基因或寡核苷酸注射到發(fā)生單堿基突變的小鼠受精卵中，能夠校正發(fā)生突變的等位基因，得到了無白內(nèi)障小鼠[15]，這是首次在完整動物中利用 CRISPR系統(tǒng)糾正致病的突變基因從而治療疾病。與此同時，Hans Clevers研究組通過CRISPR/Cas9以及一個包含插入修補序列的供體質(zhì)粒在人類干細胞中糾正了與囊性纖維化有關的缺陷，成功培育出了功能正常的微型腸[16]。他們的研究為未來該技術用于人類遺傳缺陷疾病的治療提供了希望。

圖3 RNA介導的Cas9系統(tǒng)定向[17]基因組修飾作用機制示意[17]Fig.3 Targeted genome editing with RNA-guided Cas9[17]

圖4 PAM序列在人類基因組中出現(xiàn)頻率統(tǒng)計[8]Fig.4 The frequency statistics of PAM in the human genome sequence[8]

CRISPR/Cas9作為一種新的基因打靶技術，在構(gòu)建和使用時簡單、方便，只需要靶序列的3′端含有PAM區(qū)即NGG，而在人類基因組中每8 bp就會出現(xiàn)一個PAM區(qū)[8]，如圖4。利用該技術能夠?qū)崿F(xiàn)多基因敲除、敲入或特異性干擾調(diào)控，為研究基因的功能、互作及調(diào)控網(wǎng)絡機制提供了便利，而其高效的打靶效率也為改變與特定疾病相關的基因從而為修復人類缺陷基因、建立人類重大疾病模型、小分子藥物的靶向治療和定點修復、動植物育種等提供新的途徑。

2 非人靈長類動物疾病模型的優(yōu)勢

目前，人類遺傳疾病模型的研究主要集中在果蠅、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等小動物模型上，這些小動物在研究神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機理上發(fā)揮了重要的作用[18, 19]。但是這些小動物模型并不能完全模擬人類疾病的病理變化和癥狀，如多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)退行性疾病(AD、 PD和HD)模型并不出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元細胞死亡[20-22]。此外，這些小動物壽命較短(如小鼠最多生存2～3年)，細胞器官發(fā)育，衰老過程及壽命具有種屬差異性，如表1。尤其在對自閉癥、精神分裂癥及老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，難于用小鼠模型來檢查靈長類動物所具備的復雜的認知能力和社交能力。而且，很多治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物在小鼠模型上發(fā)揮作用卻在人類臨床試驗中失敗[23]。目前，用小鼠及其它小動物模型尚未找到有效治療神經(jīng)退行性疾病的方法及藥物。因此，種屬差異可能對神經(jīng)退行性疾病病理變化影響甚大。

而非人靈長類動物(如獼猴、食蟹猴等)在生物學上與人類高度相似。2011年，我國科學家完成了食蟹猴和恒河猴基因組的比較分析[24]。獼猴與人類基因組同源性高達93%[25]，且獼猴大腦在解剖學上與人類有著極高的相似性，提示我們用靈長類動物建立疾病模型的重要性。早在2000年，研究人員將攜帶有綠色熒光蛋白GFP編碼基因的病毒載體送入猴卵細胞里，得到了世界上第一只人工遺傳改造的猴——ANDi[26]，證實了建立轉(zhuǎn)基因靈長類動物模型的可能性。隨后，Yang等利用類似病毒載體注射受精卵的方法在2008年建立了攜帶有人突變亨廷頓基因的轉(zhuǎn)基因猴模型，該人工修飾的轉(zhuǎn)基因猴模型能夠模擬出HD患者的多種主要臨床癥狀，如舞蹈病、抽搐及肌張力障礙，從而證明了首例人類疾病的靈長類動物模型的建立。此外，轉(zhuǎn)基因小猴中出生不久就表現(xiàn)出比小鼠模型更嚴重的癥狀和早期死亡[27]。這些轉(zhuǎn)基因猴疾病模型的成功建立都表明了非人靈長類動物在研究人類遺傳性疾病的發(fā)病機理上具有重要的醫(yī)學價值。

但是依賴于病毒方法對靈長類動物進行遺傳學修飾也有一定的局限性，即被轉(zhuǎn)入基因的隨機插入使得突變位點無法預知，突變數(shù)量無法控制，從而限制了動物模型的建立。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為最新的基因定向編輯技術在建立大動物模型上具有巨大的潛力，且該技術無需胚胎干細胞，將不再局限于有限種類的模式生物。最近，Niu等研究人員利用顯微注射方法將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的RNA注射到猴單細胞胚胎中，證明該系統(tǒng)對食蟹猴基因組也能進行基因修飾[12]。于此同時，世界上的其他科學家也正利用該技術開展靈長類動物疾病模型建立的工作[28]。雖然目前用靈長類動物研究CRISPR/Cas9的基因修飾功能還僅限于基因組DNA突變的檢測,可以預測CRISPR/Cas9的基因修飾功能將使靈長類動物成為我們研究重大神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及疾病的早期干預和藥物篩選的重要動物模型。

世界上共有約400余種靈長類動物，應用于生命醫(yī)學研究最常用的的靈長類動物是獼猴和食蟹猴。美國等發(fā)達國家由于宗教、倫理、經(jīng)濟等因素，使得靈長類的研究遇到了困難。而中國是靈長類動物資源豐富的國家之一，對靈長類動物的研究方面則存在許多優(yōu)勢。

目前，利用靈長類動物建立基因修飾動物模型仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。首先，陽性胚胎打靶率和移植的成功率有待于提高，尤其是考慮到靈長類動物生殖周期與繁殖期長，動物費用高等因素。其次，目前所報道的基因修飾猴存在嵌合多態(tài)性和非單點基因突變的不足之處, 是否動物身體所有細胞都具同樣的基因修飾仍待證實[12]。因此, 優(yōu)化陽性胚胎打靶率和移植的成功率是建立靈長類動物模型的關鍵。

表1 動物種屬間的重要生物特性差別Tab.1 Biological characteristics of differences between animal species

3 展望

基因編輯新技術CRISPR/Cas9系統(tǒng)的飛速發(fā)展使得動物疾病模型的建立不再局限于少數(shù)的模式生物，使得在所有物種中實現(xiàn)基因組編輯成為可能。該技術使用方便、簡單且打靶效率較高，但同時也存在潛在脫靶效應、在胚胎不同階段的多次打靶使得基因編輯具有嵌合多態(tài)性等缺陷性。在未來的研究中，如何改進該技術的脫靶效應和基因打靶的時空效應以避免突變多態(tài)性將是關鍵問題。由于靈長類動物在神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)上與人類具有高度的相似性，而且我國靈長類動物資源豐富, 利用先進的基因編輯技術CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人類重大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的靈長類動物模型將是未來生物醫(yī)學研究發(fā)展的趨勢，同時也是我國生命科學研究的優(yōu)勢和發(fā)展機遇。

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CRISPR/Cas9 system: a new gene modification tool for establishing disease models in non-human primates

YANG Wei-li, TU Zhu-chi, LI Xiao-jiang

(State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

Animal models are highly valuable systems that have been extensively used to elucidate human disease pathogenesis and to find therapeutic ways to treat human diseases. Since non-human primates are close to humans,monkeys are important model species in exploring the mechanisms and treatment of human neurodegenerative diseases, neuropsychiatric disorders, cognitive function, and neural circuits. However, due to the lack of embryonic stem cell lines in large animals, the traditional gene targeting technology is difficult to establish primate animal models of human diseases. CRISPR/Cas9, as a recently developed tool for genome modifications, has been successfully used to target genomic loci in mouse, rat, monkey, and other species. Here, we discuss the utilization of CRISPR/Cas9 technology in establishing monkey models for studying human neurodegenerative diseases.

CRISPR/Cas9 system; Non-human primates; Neurodegenerative diseases.

科技部國家重大科學研究計劃項目(課題編號：2012CBA01304)和分子發(fā)育生物學國家重點實驗室經(jīng)費資助。

楊偉莉(1987-)，研究生，主要研究方向：神經(jīng)退行性疾病，E-mail: weiliyang@genetics.ac.cn。

李曉江(1957-)，研究員，主要研究方向：神經(jīng)退行性疾病，E-mail: xjli@genetics.ac.cn

R33

A

1671-7856(2014) 08-0070-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.016

2014-06-23