吳雋松，成秀梅，羅 斌

(1. 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 鹽城 江蘇 224005； 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰 湖北 442000)

癲癇(epilepsy)為除腦卒中外最為常見的神經(jīng)變性疾病，是由多種病因引起的慢性腦功能障礙綜合征，其典型癥狀為大腦神經(jīng)元發(fā)作性異常放電導(dǎo)致臨床反復(fù)癇性發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近年來癲癇發(fā)病機(jī)制研究受到廣泛重視，在神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道、突出的可塑性、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等與癲癇的相關(guān)性方面做了大量研究。研究二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside，TSG)是何首烏中特有的水溶性生物活性成分，具有多種生物學(xué)功能，如提高學(xué)習(xí)記憶能力、改善神經(jīng)細(xì)胞突觸超微結(jié)構(gòu)等[1-2]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作可能導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、壞死，繼而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞增殖，同時在癲癇發(fā)病過程中，神經(jīng)細(xì)胞增殖往往伴隨著明顯的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)學(xué)及生化指標(biāo)的改變，可能是出于神經(jīng)細(xì)胞代償性保護(hù)、修復(fù)作用。本研究通過海人酸(kainic acid, KA)致癇大鼠模型模型，初步探討二苯乙烯苷(TSG)干預(yù)對海馬細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物模型的建立及分組

SD大鼠，SPF級，(180～220)g，雄性，均由江蘇省藥物研究所提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(蘇)2005-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用合格證號：SYXK(蘇)2012-0042。動物分籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12/12 h 的恒溫環(huán)境，每籠5只，自由攝食和飲水，保持整潔，2 d打掃一次鼠籠。取成年SD雄性大鼠54只，隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組18只、KA模型組18只、TSG干預(yù)組18只(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的劑量，給藥劑量3 mg/kg)，造模前30 min腹腔注射給藥，模型組、假手術(shù)組給予等劑量生理鹽水。采用海人酸(KA)模型制備，SD大鼠腦立體定向儀固定后，選擇右側(cè)側(cè)腦室為靶點(diǎn)，注射坐標(biāo)為(ML 2.0, AP-1.0, DV-4.0)，將KA 1 μL (濃度為0.5 μg/μL )注射入側(cè)腦室內(nèi)，注射速度1 μL/min，留針10 min。大鼠癲癇發(fā)作2 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。TSG干預(yù)組致癇后6 h腹腔內(nèi)注射TSG溶液(3 mg/kg)劑量，次日開始每日8時給與腹腔注射TSG溶液(3 mg/kg)劑量，每日1次，連續(xù)注射，共注射42 d，KA模型組動物及假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔內(nèi)注射。

1.2 藥品與儀器

TSG 購自中國藥品生物制品檢定所，含量大于98%，符合中國食品藥品檢定研究院制定的標(biāo)準(zhǔn)，HPLC標(biāo)準(zhǔn)[3]；BrdU及抗體購自美國Sigma公司；GFAP (glial fibrillary acid protein)抗體購自武漢博士德公司；二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；其他均為國產(chǎn)分析純；冰凍切片機(jī)： Leica-CM1900；生物顯微攝像系統(tǒng)：倒置熒光顯微鏡(Olympus CKX31)。

1.3 TSG給藥方法動物實(shí)驗(yàn)

參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)動物學(xué)藥劑換算方法[4-5]，確定劑量為(3 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑量、溶與蒸餾水制成藥液，4℃保存。致癇后6 h腹腔內(nèi)注射給藥，次日開始每日8時給與腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射六周，共注射42 d。模型組動物及假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔內(nèi)注射。

1.4 BrdU 標(biāo)記法

BrdU溶生理鹽水，10 mg/mL (50 mg/kg)，每2 h注射1 次，共4 次。于各組大鼠于處死前1 d腹腔注射，最后1 次注射結(jié)束24 h后處死動物。

1.5 GFAP疫組織化學(xué)染色

所有組別分別在手術(shù)或者假手術(shù)后第42 天處死取腦。大鼠在0.07 g/mL水合氯醛麻醉下，分離暴露出心臟后經(jīng)左心室插管至主動脈，先后灌注生理鹽水200 mL，4%多聚甲醛磷酸緩沖液250 mL。灌畢取腦后置于40 g/L 多聚甲醛后固定6 h, 浸于30%蔗糖液內(nèi), 4℃條件存放24 h。取腦干于恒冷箱切片機(jī)(Leica-CM1900)行冠狀冰凍切片, 片厚25 μm, 每隔5片取1 片, 每只動物取5 片, 取一套切片行SABC 免疫組織化學(xué)染色。以單克隆抗GFAP 抗體( 1:1000,武漢博士德) 作為I抗，生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶200,武漢博士德)為二抗，DAB顯色。顯色之后, 常規(guī)脫水、透明和封片。

1.6 免疫組化染色圖像分析

根據(jù)使用說明書進(jìn)行BrdU的免疫組化染色操作。步驟：采用SP法，以小鼠抗BrdU單克隆抗體(Sigma)作為I抗，生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶200，Sigma)為II抗，DAB顯色。核內(nèi)棕黃色顆粒為陽性著色。

1.7 BrdU標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)

應(yīng)用Olympus倒置相差熒光顯微鏡觀察免疫組化切片，Leica-CM1900數(shù)字纖維照相機(jī)采集圖像，各組切片均在同一光強(qiáng)度下,同一放大倍數(shù)(400×)下分析。每例動物取兩張切片，測CA1區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)目。隨意取5個視野，確認(rèn)并記錄每個視野內(nèi)海馬GFAP、海馬齒狀回顆粒層BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目，各組取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用Image．Pro Plus5.0版軟件進(jìn)行圖像處理，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生

假手術(shù)組、模型組、TSG干預(yù)組每視野內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為 (7.03±2.81)，( 13.32 ±1.85)，( 20.03 ±2.32) 個，方差分析差異顯著( F=133.66,P=0.00)。兩兩比較, 均差異有顯著性(圖1，見文后彩插2)。

2.2 各組大鼠腦組織BrdU免疫組織化學(xué)染色觀察

假手術(shù)組、TSG干預(yù)組、模型組每視野內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為 (46.16±2.48)， ( 37.67 ±1.21)，( 29.50 ±1.52) 個，方差分析差異顯著( F=377.58,P=0.00)。模型組大鼠與對照組比較，海馬齒狀回區(qū)BrdU陽性細(xì)胞核明顯增加(P<0.01)，TSG干預(yù)組與模型組相比，海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，見文后彩插2)。

3 討論

近年來有學(xué)者提出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)假說，該假說認(rèn)為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由神經(jīng)元細(xì)胞和突起(軸突、樹突)等組成，在基因和內(nèi)環(huán)境的共同作用下，大腦神經(jīng)元異常頻繁放電可致大腦海馬神經(jīng)元廣泛損傷甚至壞死、凋亡，并可以促使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生[6]。故癲癇腦損傷既是癲癇發(fā)作的果，又是癲癇頻發(fā)的因。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白，常被用來特異性標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后模型組在海馬齒狀回GFAP表達(dá)顯著升高，細(xì)胞明顯呈現(xiàn)激活狀態(tài)，胞體增大且不規(guī)則，突起數(shù)量增多、形態(tài)增粗變長。Katsumoto等[7]認(rèn)為癲癇發(fā)作的急性期引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能參與K+、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，對于恢復(fù)腦神經(jīng)元細(xì)胞外穩(wěn)態(tài)有一定積極作用。在潛伏期，一方面星形膠質(zhì)細(xì)胞自身大量增生，另一方面激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放一系列細(xì)胞因子引起小膠質(zhì)細(xì)胞增生，占據(jù)腦內(nèi)空間且干擾甚至切斷了神經(jīng)元之間或者神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的正常聯(lián)系，故膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元具有“雙刃劍”的作用[8]。

Scharfman等[9]在癲癇大鼠齒狀回區(qū)發(fā)現(xiàn)大量新生顆粒細(xì)胞，且這種異常的顆粒細(xì)胞可以無規(guī)律的結(jié)合、興奮、爆發(fā)異常的興奮性突觸后電位(EPSP)。BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在DNA合成過程中嵌入S期細(xì)胞的細(xì)胞核中，嵌入合成的強(qiáng)度顯示其細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)弱，因此BrdU被認(rèn)為是反映新生活性細(xì)胞的理想指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)生后，觀察大鼠海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞下層存在BrdU陽性細(xì)胞異常增殖，鏡下呈圓形或者橢圓形結(jié)構(gòu)。此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)到結(jié)果一致[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示二苯乙烯苷能降低GFAP的過度表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。近年來神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、遷移成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的新熱點(diǎn)。有學(xué)者提出運(yùn)用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植是修復(fù)和替代缺失神經(jīng)元的有效方法，可部分重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，但這種內(nèi)源性的再生修復(fù)因只有不到50%的神經(jīng)元能夠分化成熟并且遷移到受損部位成功建立突觸聯(lián)系，或者偏向不理想方向發(fā)展(如形成瘢痕)[11]。這使得干細(xì)胞移植成為可能，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后需借助干預(yù)條件動員神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其遷移、分化修復(fù)損傷，嚴(yán)格控制其神經(jīng)再生作用。總之，神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，為神經(jīng)移植與腦損傷修復(fù)指明了新的道路[12]。

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