張文通 魏鳳,2 李峰,2 苗立中,2 沈志強(qiáng),2

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豬流產(chǎn)嗜性衣原體病診斷方法研究進(jìn)展

張文通1魏鳳1,2李峰1,2苗立中1,2沈志強(qiáng)1,2

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬流產(chǎn)嗜性衣原體病是引起母豬流產(chǎn)，產(chǎn)弱胎、死胎的重要傳染病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。正確診斷對(duì)防制該病極為關(guān)鍵。本文就該病的病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷方法進(jìn)行了綜述。

豬流產(chǎn)嗜性衣原體；診斷方法；進(jìn)展

豬流產(chǎn)嗜性衣原體病的病原是流產(chǎn)嗜性衣原體，該病原能導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、公豬生殖道疾病，甚至能導(dǎo)致孕婦感染而引起流產(chǎn)。隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病的感染率有所增加，已受到越來(lái)越多從事養(yǎng)豬業(yè)工作者的重視。在國(guó)外，Willigan等[1]首先于1955年從患病豬病料中分離到該病的病原；在國(guó)內(nèi)，楊宜生等[2]于1982年首次從流產(chǎn)母豬及患關(guān)節(jié)炎仔豬病料中分離到該病的病原。目前，全國(guó)大多數(shù)養(yǎng)豬地區(qū)都有關(guān)于該病的報(bào)道。邱昌慶等[3]、何啟蓋等[4]、羅建等[5]對(duì)部分地區(qū)豬血清衣原體陽(yáng)性率進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)該病抗體陽(yáng)性率普遍很高，說明該病在我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)中廣泛存在，應(yīng)引起從業(yè)人員的高度重視。目前該病還沒有有效疫苗可供使用。本文就豬流產(chǎn)嗜性衣原體病的診斷方法進(jìn)行綜述，旨在為廣大從事養(yǎng)豬生產(chǎn)或研究的工作人員提供參考。

1 病原學(xué)研究

1.1 病原的分離培養(yǎng)

病料分離常用的方法是雞胚傳代法和細(xì)胞培養(yǎng)法。雞胚傳代法最為常用。將病料（病料采集取自有癥狀或病變部位，比如流產(chǎn)胎兒器官、胎盤和子宮分泌物，患關(guān)節(jié)炎的也可采集關(guān)節(jié)液）接種于孵化5～7天的雞胚卵黃囊內(nèi)。對(duì)于不能適應(yīng)雞胚傳代的菌株或初次分離的菌株，建議將病料接種于無(wú)特定病原的小鼠或豚鼠。也可將病料接種于McCoy或HeLa229細(xì)胞或BHK細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，但實(shí)際工作中因耗時(shí)、工作量大等難點(diǎn)并不常用，不適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

1.2 病原的鑒定

將采自典型部位病料或卵黃囊培養(yǎng)物涂片，Gimenez法染色鏡檢，可見藍(lán)綠色、直徑約為0.5～1.4μm小大的圓形產(chǎn)物，部分位于細(xì)胞內(nèi)，大量散布于細(xì)胞外，聚集的群體形成網(wǎng)狀小體。也可將病變組織涂片，采用姬姆薩染色法，鏡檢可觀察到菌體呈紫紅色或?qū)毷t色，直徑大約為0.1～0.6μm，并可觀察到紅色的胞漿內(nèi)包涵體。直接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）是OIE推薦的診斷方法，有商品化的試劑盒。將熒光標(biāo)記的多克隆抗體或單克隆抗體滴加到組織抹片或者細(xì)胞片，37℃濕盒孵育30分鐘，然后用PBS沖洗3次，自然晾干，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，陽(yáng)性的可見綠色熒光的包涵體。

2 血清學(xué)方法

2.1 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

間接血凝試驗(yàn)是將抗原（或抗體）包被于紅細(xì)胞表面，成為致敏的載體，然后與相應(yīng)的抗體（或抗原）結(jié)合，從而使紅細(xì)胞拉聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。該方法在臨床檢驗(yàn)中已得到廣泛應(yīng)用。目前市場(chǎng)上已經(jīng)有產(chǎn)自湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所和中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所的商品化流產(chǎn)嗜性衣原體間接血凝試劑盒，文獻(xiàn)研究顯示該試劑盒已在全國(guó)被廣泛應(yīng)用于衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查。

2.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是指利用抗原抗體復(fù)合物同補(bǔ)體結(jié)合，把含有已知濃度補(bǔ)體反應(yīng)液中的補(bǔ)體消耗掉，使?jié)舛冉档偷默F(xiàn)象，以檢出抗原或抗體的試驗(yàn)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是OIE推薦的經(jīng)典診斷方法，已廣泛用于家畜衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查。但該方法操作步驟過于復(fù)雜、需要專業(yè)知識(shí)操作，因此在基層應(yīng)用推廣中受到很大限制。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)（IMIF）

間接免疫熒光試驗(yàn)其染色原理分兩步：第一步，將未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30分鐘，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體；第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體；如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。間接免疫熒光試驗(yàn)缺陷在于操作步驟繁瑣、特異性差等，不利于實(shí)際推廣及應(yīng)用開發(fā)。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。間接ELISA法用于測(cè)定特異抗體。ELISA方法具有快速、準(zhǔn)確、特異、敏感、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

科研工作者在建立檢測(cè)流產(chǎn)嗜性衣原體抗體ELISA方法上做了大量研究工作。1995年Anderson等[6]將衣原體進(jìn)行純化，將純化后的衣原體原體作為ELISA的包被物，建立了ELISA檢測(cè)方法。1996年Griffiths等[7]將純化后的脂多糖抗原（從衣原體表面抗原中提?。┳鳛榘晃铮⒘薊LISA檢測(cè)方法，該方法與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)羊血清，結(jié)果表明ELISA方法敏感度高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。

40 kDa的衣原體主要外膜蛋白（MOMP）具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，是衣原體病診斷的主要研究抗原。1997年Kaltenboeck等[8]合成衣原體主要外膜蛋白中的部分肽片段，作為包被物，建立了間接ELISA方法，該方法與以其他衣原體抗原作為包被物建立的ELISA方法相比，敏感性更高。同年，Salti-Montesanto等[9]在獲得流產(chǎn)嗜性衣原體單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

2001年Buendía等[10]以重組流產(chǎn)嗜性衣原體80～90 kDa蛋白抗原為包被物建立ELISA方法，與以純化的衣原體原體進(jìn)行包被建立的ELISA方法相比，敏感性更高。2006年Rekiki等[11]制備了以流產(chǎn)嗜性衣原體重組80～90 kDa家族蛋白作為包被原的ELISA試劑盒，但該試劑盒與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)符合率只有61.1%，與以純化的衣原體原體進(jìn)行包被建立的ELISA方法符合率只有65%。

多型性外膜蛋白（POMP）可以產(chǎn)生很高的免疫活性，也常被作為候選抗原用于研制診斷試劑。2007年Mccauley等[12]采用基于POMP90-3、POMP90-4、POMP80-90和MOMP建立的ELISA方法和CFT方法檢測(cè)陽(yáng)性血清；結(jié)果表明，敏感性POMP90-3＞POMP90-4＞POMP80-90＞MOMP＞CFT，特異性CFT和POMP90-4＞MOMP＞POMP80-90＞POMP90-3。2009年梅仕林[13]采用以重組流產(chǎn)嗜性衣原體POMP蛋白為包被抗原，建立檢測(cè)豬流產(chǎn)嗜性衣原體抗體的間接ELISA方法。特異性研究表明，該方法檢測(cè)豬乙腦陽(yáng)性血清、豬偽狂犬陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清及豬繁殖與呼吸綜合征陽(yáng)性血清均陰性，具有很好的特異性；符合率試驗(yàn)顯示，該ELISA方法與IHA方法符合率為92.8%。應(yīng)用該方法調(diào)查河南、湖北、安徽及廣東四個(gè)省份的豬場(chǎng)，試驗(yàn)豬群均有豬流產(chǎn)嗜性衣原體感染，陽(yáng)性率平均在30.7%。

3 分子生物學(xué)方法

PCR診斷技術(shù)又叫多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，它采用分子技術(shù)模擬核酸在體內(nèi)的復(fù)制，從而判定疾病病原的種類。PCR技術(shù)不需要觀察動(dòng)物的外觀表現(xiàn)，所以無(wú)論是在潛伏期還是暴發(fā)期，只要對(duì)動(dòng)物的相應(yīng)器官進(jìn)行檢測(cè)，在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)就能準(zhǔn)確判定出畜禽疾病的病原。由于PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，科研工作者運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)豬流產(chǎn)嗜性衣原體病進(jìn)行了大量研究。

1997年Messmer等[14]根據(jù)16s rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了兩步PCR方法，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法敏感度遠(yuǎn)高于分離培養(yǎng)法。2001年Laroucau等[15]根據(jù)流產(chǎn)嗜性衣原體的pomp基因保守序列，設(shè)計(jì)引物，建立PCR方法。該方法與RFLP分析方法一起，可以對(duì)流產(chǎn)嗜性衣原體種和血清型進(jìn)行鑒定。2005年Markey等[16]根據(jù)衣原體16s rRNA基因保守序列設(shè)計(jì)引物，也建立了實(shí)時(shí)定量PCR方法，通過檢測(cè)陽(yáng)性病料，比較該方法與常規(guī)PCR方法的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果表明常規(guī)PCR方法檢測(cè)陰性的12份病料，而實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。

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