朱 亮，屠 玨，黃 宇，陳 誠(chéng)

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

哺乳動(dòng)物的虹膜和毛色作為其最醒目的可見(jiàn)性狀，與相應(yīng)組織中的黑色素分布有密切的關(guān)系。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的黑色素根據(jù)胚胎起源的不同可分為多個(gè)類型，且調(diào)節(jié)各個(gè)類型黑色素的機(jī)制互有差異。當(dāng)動(dòng)物的顏色性狀發(fā)生突變時(shí)，有必要通過(guò)組織學(xué)的方法弄清突變個(gè)體相應(yīng)組織中的色素細(xì)胞類型和數(shù)量構(gòu)成上的變化，從而為后續(xù)研究提供線索。我中心從日本大耳白兔種群中發(fā)現(xiàn)黑眼突變個(gè)體并保種建立封閉群，經(jīng)鑒定命名為日本大耳兔黑眼系，簡(jiǎn)稱白毛黑眼兔(white hair black eyes rabbit，WHBE兔)?，F(xiàn)對(duì)該封閉群個(gè)體的虹膜和皮膚組織進(jìn)行組織學(xué)觀察，并與其他品種實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行對(duì)比。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取四個(gè)不同品種的實(shí)驗(yàn)兔作為實(shí)驗(yàn)材料：日本大耳白兔、白毛黑眼兔、獺兔和青紫蘭兔。其中，白毛黑眼兔和日本大耳白兔來(lái)自于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心實(shí)驗(yàn)兔繁育中心【SCXK(浙)2009-0042】。獺兔購(gòu)于新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場(chǎng)【SCXK(浙)2009-0042】。青紫蘭兔購(gòu)于南京安立默科技有限公司【SCXK(蘇)2010-0002】。每個(gè)實(shí)驗(yàn)兔品種分別選取2只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心的實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(浙)2013-0184】。

日本大耳白兔是我國(guó)常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)用兔，表型呈現(xiàn)出完全白化，皮膚和被毛雪白(圖1A)，虹膜無(wú)色素沉積，呈現(xiàn)紅色(圖1E)。白毛黑眼兔是來(lái)自日本大耳白兔種群的突變個(gè)體經(jīng)十四年保種培育而建立的一個(gè)新實(shí)驗(yàn)兔封閉群。該品種家兔皮膚和被毛呈現(xiàn)與突變背景品系日本大耳白兔一樣的完全雪白，無(wú)任何有色花紋或斑點(diǎn)(圖1B)，而其虹膜則出現(xiàn)色素沉積，呈現(xiàn)深灰色(圖1F)。獺兔和青紫蘭兔是20世紀(jì)早期培育于法國(guó)，20世紀(jì)50年代引入我國(guó)的品種。由于長(zhǎng)期本地飼養(yǎng)，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有獺兔和青紫蘭兔種群與原有品種發(fā)生了遺傳分化，并成為我國(guó)目前主要的實(shí)驗(yàn)和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物品種。白化獺兔，全身皮膚和被毛雪白，沒(méi)有任何斑點(diǎn)或雜色毛(圖1C)，虹膜無(wú)色素沉積，呈現(xiàn)紅色(圖1G)。青紫藍(lán)兔大部分被毛呈藍(lán)灰色，耳尖及尾背面黑色，眼圈、尾底及腹部白色，腹毛基部淡灰色(圖1D)，虹膜呈現(xiàn)深褐色(圖1H)。

1.2 方法

取四個(gè)品種的實(shí)驗(yàn)兔實(shí)施安樂(lè)死后，分別取虹膜組織和背部皮膚組織(2 cm×2 cm)，固定于10%緩沖中性甲醛。組織按常規(guī)脫水包埋，切片脫蠟至水，放入硫酸亞鐵液中處理30min。隨后用蒸餾水洗3次，每次5 min。接著用鐵氰化鉀醋酸液處理30 min，隨即用1%醋酸水溶液稍加清洗。作為對(duì)比染色，用Van Gieson染液復(fù)染約1 min，蒸餾水速洗。最后經(jīng)95%乙醇脫水、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固等步驟完成制片。光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

經(jīng)HE硫酸亞鐵法染色后，黑色素呈現(xiàn)綠色，含量越高則綠色越深，用Van Gieson染液復(fù)染的膠原纖維呈紅色，肌纖維呈黃色，染色均勻清晰。圖2顯示組織中黑色素染色效果清晰，黑色素染色與間質(zhì)組織的背景對(duì)比鮮明。

從染色結(jié)果可見(jiàn)，虹膜的前表面無(wú)上皮，由成纖維細(xì)胞和色素細(xì)胞組成不連續(xù)的前緣層(↑)。虹膜基質(zhì)為疏松結(jié)締組織(*)。白毛黑眼兔和青紫蘭兔的虹膜基質(zhì)中，靠近虹膜前表面的區(qū)域分布著許多被染成墨綠色的黑色素(圖2A、圖2D)。虹膜后表面的虹膜上皮由兩層細(xì)胞組成(↑↑)，前層特化為肌上皮細(xì)胞，后層由體積較大的色素細(xì)胞組成。白毛黑眼兔和青紫蘭兔的虹膜上皮緊密排列著黑色素，形成黑色素層(圖2A、圖2D)。與之相反，日本大耳白兔和白化獺兔的虹膜基質(zhì)(圖2B、圖2C)和虹膜上皮(圖2B、圖2C)相應(yīng)部位觀察不到黑色素分布。

家兔身體表皮的角質(zhì)層很薄。真皮內(nèi)可見(jiàn)較多毛囊。青紫蘭兔的毛囊內(nèi)可見(jiàn)被染成墨綠色的黑色素分布(圖2H)。在白毛黑眼兔的真皮層的毛囊中也有黑色素分布，但染色較淺，呈淺綠色(圖2E)。而日本大耳白兔和白化獺兔的表皮真皮層中未觀察到黑色素分布(圖2F、圖2G)。

3 討論

黑色素是產(chǎn)生于特定種類細(xì)胞中的一種生物色素，是由酪氨酸經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)所形成的。黑色素生成、轉(zhuǎn)移和附著的過(guò)程稱為色素沉積。不同個(gè)體間色素沉積的差異使哺乳動(dòng)物的體表顏色深淺不一、多種多樣。

哺乳動(dòng)物的虹膜顏色和皮毛顏色傾向于趨于一致，皮毛顏色深則虹膜顏色也深，反之亦然。但有皮毛和虹膜顏色深淺差異較大的動(dòng)物品系存在[1]。比如beige小鼠的皮毛呈現(xiàn)較淺的米黃色而虹膜顏色很深。與之類似的是本研究使用的白毛黑眼兔，其虹膜顏色黑而皮毛白，色差極大。

造成這一現(xiàn)象的黑色素體內(nèi)分布，可以追溯到胚胎發(fā)生階段。胚胎學(xué)研究的結(jié)果顯示，影響皮毛顏色的黑素細(xì)胞全部起源于胚胎神經(jīng)嵴，且僅有這一個(gè)來(lái)源。而對(duì)虹膜來(lái)說(shuō)，其色素細(xì)胞有三種不同類型的來(lái)源：1)來(lái)自于胚胎神經(jīng)嵴的細(xì)胞最終構(gòu)成了虹膜基質(zhì)色素細(xì)胞；2)位于虹膜色素上皮中的色素細(xì)胞則來(lái)自于胚胎神經(jīng)上皮；3)另外，位于虹膜基質(zhì)中的、來(lái)自于骨髓的抗原遞呈細(xì)胞也會(huì)在吞噬作用的次級(jí)影響下成為色素細(xì)胞[2]。也就是說(shuō)與胚胎神經(jīng)嵴源黑素細(xì)胞相關(guān)的基因可以同時(shí)影響虹膜和皮毛的顏色，而與另兩個(gè)黑素細(xì)胞胚胎起源相關(guān)的基因則只影響虹膜顏色。假設(shè)由于基因突變等原因?qū)е屡咛ド窠?jīng)嵴起源的黑素細(xì)胞缺失，而其他來(lái)源黑素細(xì)胞正常，可能出現(xiàn)虹膜有色而皮毛無(wú)色的情況。本研究通過(guò)對(duì)不同品種實(shí)驗(yàn)兔組織切片染色結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)白毛黑眼兔的虹膜色素上皮和虹膜基質(zhì)中都有黑色素分布，跟青紫蘭兔的分布一致。也就是說(shuō)，白毛黑眼兔表現(xiàn)出的虹膜與皮毛顏色表型的明顯反差并非是由胚胎神經(jīng)嵴起源的色素細(xì)胞缺失造成的。

除此之外，皮毛和虹膜這兩種組織中黑色素補(bǔ)償機(jī)制的差異提示我們，參與黑素體轉(zhuǎn)運(yùn)的某些蛋白也可以單獨(dú)影響皮毛顏色從而出現(xiàn)虹膜有色皮毛無(wú)色的表型。哺乳動(dòng)物皮毛顏色的維持需要黑色素持續(xù)地生成并被不斷轉(zhuǎn)運(yùn)到生長(zhǎng)狀態(tài)的毛干里，而虹膜內(nèi)的黑色素只需生成不需要轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。對(duì)四種實(shí)驗(yàn)兔皮膚組織的鏡檢發(fā)現(xiàn)，在白毛黑眼兔的真皮層毛囊中確有黑色素分布，但呈現(xiàn)的染色結(jié)果較青紫蘭兔淺得多，顯示黑色素含量較低。而且白毛黑眼兔終生被毛雪白，說(shuō)明其毛干中不含有黑色素。一般認(rèn)為，黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可以用細(xì)胞吞噬理論、釋放理論和融合理論來(lái)解釋[4]。目前已有的研究表明，該轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程涉及的若干關(guān)鍵蛋白與體表色素有直接關(guān)系[5-6]。例如，當(dāng)在黑素顆?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用的Rab27蛋白缺乏時(shí)，個(gè)體會(huì)出現(xiàn)以皮膚和毛發(fā)色素減退為臨床表現(xiàn)之一的Griscelli綜合征[6]。因此，對(duì)黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及基因的進(jìn)一步研究，將對(duì)認(rèn)識(shí)白毛黑眼兔突變表型的機(jī)制有所幫助。

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