謝 健 霍金海 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·150036）

核桃楸葉為胡桃科胡桃屬植物核桃楸（Julans Mandshurica Maxim.）的樹葉。原植物核桃楸為胡桃科胡桃屬落葉喬木，主要分布于中國東北、華北、河北等地區(qū)，其種子、青果，樹皮均可入藥[1-2]。

核桃楸葉作為核桃楸新的藥用部位，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗腫瘤[3]、抗氧化、抑菌[4]等活性，目前，學(xué)者已從核桃楸葉中分離出醌類、黃酮類、萜類、多酚類等多類型化合物，這些研究為核桃楸葉的開發(fā)提供了基礎(chǔ)，但目未見關(guān)于核桃楸葉的質(zhì)量控制的方法。

核桃楸葉中含有豐富的黃酮類成分，其中槲皮素和山奈酚是其典型代表化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)也表明槲皮素和山奈酚均具有抗腫瘤、抗氧化等活性[5]，因此槲皮素和山奈酚可以作為控制核桃秋葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分。本文采用HPLC法測定核桃楸葉中上述兩種功效成分的含量，為核桃楸葉的開發(fā)提供研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津），BP211D型電子天平（Sartorius公司），DZG-303A超純水機(jī)（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（100081-200406）；山奈酚對照品（110861-200406）均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

核桃楸葉樣品分別采于黑龍江省伊春市、五常市、賓縣、方正、哈爾濱市，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院初東君主任藥師鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)的葉子，陰干后粉碎。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品的配制 精密稱取槲皮素，山奈酚對照品各2.53mg、3.71mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為101.2μg·mL-1，148.4μg·mL-1溶液，0.45μmL濾膜過濾，得對照品溶液備用。

2.1.2 供試品的配制 取核桃楸葉約1.0g，精密稱定，加甲醇25mL，稱定重量，80℃回流1h，冷卻，甲醇補(bǔ)足失重，過濾，微孔濾膜（0.45μmL）濾過，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸（57:43），流速1.0mL·min-1，檢測波長360nm，柱溫：35℃，進(jìn)樣量10μL。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液和供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，結(jié)果表明在此色譜條件下，槲皮素，山奈酚分離良好，分離度均＞1.5，且理論塔板數(shù)均不低于4000。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素，山奈酚對照品溶液2.5、5.0、10、20、25μL，測定峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，槲皮素、山奈酚量為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得回歸方程：槲皮素Y＝3423.3x＋5.2652（r=0.9998），山奈酚Y＝3313.1x＋5.9435(r=0.9999)。結(jié)果表明，槲皮素在0.253μg～2.53μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，山奈酚在0.371μg～3.71μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度考察

分別精密吸取槲皮素，山奈酚對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測定兩種對照品的峰面積。結(jié)果，槲皮素，山奈酚峰面積的RSD分別為0.71%，0.65%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一供試品溶液10μL，在0，2，4，6，8，10，12，24h進(jìn)樣，記錄供試品溶液中槲皮素，山奈酚的峰面積，計算各成分含量。樣品中槲皮素，山奈酚含量的RSD分別為1.26%，1.38%，表明樣品樣品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1.2項(xiàng)下供試品處理方法平行處理6份樣品，測定2種成分的峰面積，計算含量。結(jié)果樣品中槲皮素，山奈酚含量的RSD分別為1.06%，1.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的核桃楸葉粉末0.5g，共6份。分別精密加入與藥材相當(dāng)量的槲皮素對照品（0.8 mg·mL-1）1mL，山奈酚對照品溶液(0.5 mg·mL-1）1mL，按2.1.2項(xiàng)下供試品制備方法制備，進(jìn)樣10μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD值，結(jié)果見表1、表2，測定槲皮素的平均回收率為98.62%、RSD值為1.45%；山奈酚平均回收率為99.02%、RSD值為1.11%。

表1 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 山奈酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

取五個產(chǎn)地樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行兩種成分的含量測定，結(jié)果見表3。

表3 五個產(chǎn)地核桃秋葉的槲皮素、山奈酚含量 （mg·g-1）

3 討論

3.1 波長的選擇

考察了250nm，265nm，280nm，360nm不同吸收波長的圖譜，發(fā)現(xiàn)在360nm處，其吸收值達(dá)到最大，圖譜特征性強(qiáng)，故以360nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-0.2%磷酸體系來分離，考察甲醇-0.2%磷酸57:43，55:45，53:47，50:50，最后確立了以甲醇-0.2%磷酸（57:43）為流動相分離度最好，確定流速為1.0mL/min。

3.3 提取條件的選擇

在樣品制備過程中，以超聲和加熱回流提取作對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加熱回流是超聲提取的含量的一倍，后者提取效果比較好，另考察了提取時間，結(jié)果以每次1小時為最佳，最后以甲醇80℃回流1h為最佳。

本文建立了高效液相同時檢測核桃秋葉中槲皮素和山奈酚的方法，簡便快捷，容易掌握，對核桃秋葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究起到了一定的作用。

[1]呂海寧，折改梅，呂揚(yáng).核桃和核桃楸的化學(xué)成分及生物活性的研究進(jìn)展.華西藥學(xué)雜志[J].2010,25（4）：489-493.

[2]孫墨瓏，宋湛謙，方桂珍.核桃楸總黃酮及胡桃醌含量測定.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)[J]. 2006，26（2）：93-95.

[3]宋華，包永明，張紅梅，等.核桃秋葉提取液對腫瘤細(xì)胞的抑制作用.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報[J].2001，20（2）：109-111.

[4]髙岳芳，張麗，韓穎，等.核桃屬植物葉的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展.西北林學(xué)院學(xué)報[J].2010，25（4）：165-169.

[5]周媛媛，王棟.核桃楸不同用藥部位化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展.中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志[J].2007，3（1）：8-9.

[6]王樹松，劉風(fēng)云.不同生長期柿葉總黃酮和槲皮素的含量測定.藥物鑒定[J].2007,16（9）22-23.

[7]林慧彬，谷延杰，林建強(qiáng)，等.HPLC法測定山東4種菟絲子槲皮素、山奈酚的含量.中成藥[J].2003，25（8）：649-651.

[8]浦錦寶，梁衛(wèi)青，鄭軍獻(xiàn)，等.HPLC法測定三青葉中槲皮素、山奈酚的含量.中國中醫(yī)藥科技[J].2011，18（2）：134-135.

[9]余濟(jì)海，鄒盛勤.高效液相色譜法同時測定杜仲葉蘆丁和槲皮素含量的研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)[J].2006，34（10）:2170-2171.

[10]李福榮，史衛(wèi)鋒，程國量.HPLC法測定青龍衣中胡桃醌的含量.藥物研究[J].2007,4(12):164-165.