王加謀 鄒 季 劉彤鷗

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)·430065）

骨質(zhì)疏松（OP）是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退行性改變?yōu)樘卣鳎谴嘈栽黾?，易發(fā)生骨折的一種全身代謝性骨病[1、2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis,PMO）是指主要由絕經(jīng)引起的OP。雌激素水平下降是絕經(jīng)后婦女OP發(fā)病率升高的主要原因。近年來，植物雌激素治療骨質(zhì)疏松癥的研究越來越多[3]。運(yùn)動(dòng)對(duì)于骨骼健康的特殊影響已得到了臨床試驗(yàn)和觀察研究的證實(shí)。中藥復(fù)方主要作用機(jī)制是植物性雌激素來改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。本文研究運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方法對(duì)雌性大鼠骨質(zhì)疏松的影響，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度探明其肌肉骨骼途徑上來治療骨質(zhì)疏松癥的研究。當(dāng)前對(duì)于肌肉骨骼改變與骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究較少，而且目前骨質(zhì)疏松癥的治療尚沒有一種藥物可以兼顧肌肉骨骼，因此尋找高效、低毒、兼顧全面的治療藥物是及待解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與飼料 3月齡SD雌性大鼠100只，體重250g左右，SPF級(jí)。飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。動(dòng)物和飼料均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK鄂2012-0007）。

1.1.2 藥品 杜仲、葛根、紅景天、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、藏紅花等水煎劑濃度30mg/ml（由湖北省中醫(yī)院藥劑室制備）。

1.1.3 主要儀器與試劑 線粒體提取試劑盒、純化線粒體膜通道孔比色法檢測(cè)試劑盒、組織玻角酸脫氫酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒、酶標(biāo)儀（型號(hào)：F039300）、DOUNCE勻漿機(jī)、電子分析天平（型號(hào)：AP210S）、超低溫冰箱（型號(hào)：ULTRA LOW）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16）、紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：SMART SPECPLUS）、超氧化物歧化酶（SOD）分型測(cè)試盒、紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫水溫箱（型號(hào)：BHW-1V）、電熱三用水箱（型號(hào)：DS-11）、多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（型號(hào)：TDZ5-WS）：、漩渦混勻器（型號(hào)：XH-B）、超低溫冰箱（DW-86L386型）、電熱恒溫水溫箱（型號(hào)：BHW-1V）、電熱三用水箱（型號(hào)：DS-11）、雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型建立

將100只3月齡健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（SHAM組）、去勢(shì)模型組（OVX組）、運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組，每組20只。造模方法：以1%戊巴比妥鈉（5ml/kg）進(jìn)行腹腔注射，將大鼠麻醉至穩(wěn)定狀態(tài)，下腹部備皮，消毒后經(jīng)腹部切口進(jìn)入腹腔，找出位于腎臟兩側(cè)外下方呈淡粉紅色的卵巢和緊密相連的子宮角。假手術(shù)組切除雙側(cè)卵巢周圍的脂肪組織，其余三組分別在子宮角上結(jié)扎后將雙側(cè)卵巢摘除，四組均逐層縫合關(guān)腹，術(shù)后用碘伏消毒傷口。術(shù)后2w各組動(dòng)物分別給予以下灌胃處理：SHAM組、OVX組均給予0.9%氯化鈉注射液10ml/（kg·d）；運(yùn)動(dòng)組給予0.9%氯化鈉注射液10ml/（kg·d），每天在高速平板跑臺(tái)跑步10分鐘；中藥復(fù)方組：給予中藥復(fù)方溶液（濃度30mg/ml）4ml/（kg·d），運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組：給予中藥復(fù)方溶液（濃度30mg/ml）4ml/（kg·d），每天在高速平板跑臺(tái)跑步10分鐘。各組灌胃12w。

2.2 樣本采集與保存

給藥12周，最后一次灌胃后2小時(shí)，下腔靜脈采血，人道主義處死各組大鼠，取出左、右側(cè)大腿股四頭肌組織和股骨，立即放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。SOD血樣離心后取血清-80℃冰箱保存。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用SPSS 16.0軟件包分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為多因素非平衡的組合類型，將組別拆分成兩個(gè)組合進(jìn)行比較，即模型組與假手術(shù)組進(jìn)行比較，模型組與運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組進(jìn)行比較，結(jié)果用X—±s表示，先進(jìn)行正態(tài)性分析，符合要求后各組間差異分別采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 各組骨骼肌MPTP的OD比值變化

通過計(jì)算分析0min/誘導(dǎo)前、15min/誘導(dǎo)前、30min/誘導(dǎo)前OD比值，可以了解到線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的活性變化。若OD比值降低，表明MPTP活性增強(qiáng)。在15min/誘導(dǎo)前、30min/誘導(dǎo)前OD比值的比較中，假手術(shù)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O5）；運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O5）、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O1）。見表1

表1 各組骨骼肌MPTP的OD比值（±s）

表1 各組骨骼肌MPTP的OD比值（±s）

注：與模型組比較＊（P＜0.05）、**（（P＜0.O1））

組別例數(shù)0min/誘導(dǎo)前15min/誘導(dǎo)前30min/誘導(dǎo)前假手術(shù)組組200.973±0.0280.941±0.0410.916±0.088模型組201.029±0.0731.051±0.120*1.045±0.127*運(yùn)動(dòng)組201.025±0.1071.019±0.063*1.019±0.057*中藥復(fù)方組201.068±0.0291.038±0.061*1.022±0.061*運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組201.071±0.0231.039±0.052**1.016±0.56**

3.2 各組骨骼肌肌肉蛋白含量比較

與模型組比較假手術(shù)組、運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O1）；中藥復(fù)方組與模型組比較（P＜0.O5）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2

表2 各組骨骼肌肌肉蛋白含量比較（±s）

表2 各組骨骼肌肌肉蛋白含量比較（±s）

注：與模型組比較＊（P＜0.01）與模型組比較△（P＜0.05）

組別n骨骼肌肌肉蛋白（g/L）假手術(shù)組200.735±0.112＊模型組200.601±0.237運(yùn)動(dòng)組200.721±0.231＊中藥復(fù)方組200.692±0.023△運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組200.731±0.161＊

3.3 各組大鼠血清SOD含量變化

在各組大鼠血清SOD變化比較，假手術(shù)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3

表3 各組大鼠血清SOD含量變化（±s）

表3 各組大鼠血清SOD含量變化（±s）

注：*與模型組比較，P＜0.05**與模型組比較，P＜0.01

組別例數(shù)SOD（u/ml）假手術(shù)組20138.35±8.22**模型組20115.84±14.49運(yùn)動(dòng)組20132.74±11.81*中藥復(fù)方組20129.59±15.632*運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組20136.66±13.56**

3.4 各組大鼠骨密度的變化

在各組大鼠骨密度變化比較，與模型組比較，假手術(shù)組、運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4

表4 對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響（±s）

表4 對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響（±s）

注：與模型組比較P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)劑量（ml/kg·d）骨密度（g/cm3）假手術(shù)組20100.122±0.015模型組20100.107±0.011運(yùn)動(dòng)組20100.118±0.017中藥復(fù)方組2040.119±0.015運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組2040.120±0.006

4 討論

現(xiàn)在對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究較多集中于骨“質(zhì)”、骨’“量”和改善癥狀方面。當(dāng)前對(duì)于肌肉骨骼改變與骨質(zhì)疏松的關(guān)系的研究較少，而從線粒體方面分析骨質(zhì)疏松癥的變化研究更是少之又少。本文通過分析細(xì)胞線粒體的活性變化情況，綜述有關(guān)線粒體在骨質(zhì)疏松方面的研究進(jìn)展，闡明或部分闡明肌肉骨骼組織變化和骨質(zhì)疏松互相影響的原理，為中醫(yī)藥從“腎主骨、脾主肌”角度防治骨質(zhì)疏松癥提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

在本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方的干預(yù)下運(yùn)動(dòng)和中藥復(fù)方方含藥血清可直接刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加成骨細(xì)胞表達(dá)，能抑制破骨細(xì)胞活性，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[4-8]。

通過大鼠去卵巢，建立去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型。給藥治療12周后，根據(jù)人道主義處死各組大鼠，取出左、右側(cè)股四頭肌組織，按凱基線粒體提取試劑盒說明書進(jìn)行提取骨骼肌組織內(nèi)的線粒體。提取線粒體后對(duì)各組骨骼肌MPTP在誘導(dǎo)前、Omin,15min,30min的OD值及OD比值、骨骼肌線粒體SDH活性三個(gè)方面進(jìn)行測(cè)量分析。結(jié)果顯示：（1）在骨骼肌MPTP的活性變化方面，通過計(jì)算分析0min/誘導(dǎo)前、15min/誘導(dǎo)前、30min/誘導(dǎo)前的OD比值，15min/誘導(dǎo)前、30min/誘導(dǎo)前的OD比值模型組均比假手術(shù)組、運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O5）。提示運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方血漿具有抑制成骨細(xì)胞MPTP活性的作用，能有效延緩成骨細(xì)胞MPTP的開放，起到預(yù)防成骨細(xì)胞線粒體損傷的作用。運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組效果更有意義。提示本實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方的方法對(duì)去勢(shì)大鼠骨骼肌肌肉蛋白的提高時(shí)有顯著作用的。

SOD是一類清除自由基的蛋白酶，對(duì)需氧生物的生存起著重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O2-）保護(hù)細(xì)胞免受損傷，是生物體防御氧毒性的關(guān)健。從表3可以看出，模型組中SOD的含量最低，提示該組產(chǎn)生了大量的自由基，但通過藥物干預(yù)后，觀察組和對(duì)照組SOD的含量提高，提提示運(yùn)動(dòng)、中藥復(fù)方和運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方均能提高大鼠血清SOD的含量，可以在一定程度上提高清理自由基的能力。通過大鼠去勢(shì)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。給藥治療12周后，下腔靜脈取血，每只SD大鼠采血約5ml，貼標(biāo)簽，離心獲取血清，滅活，抽濾除菌。按照試劑盒說明書方法對(duì)大鼠血清SOD含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：（1）大鼠血清SOD含量變化方面，假手術(shù)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O1）；運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O5）運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.O5）。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方對(duì)去勢(shì)大鼠SOD的影響有意義。從表4中可以看出骨密度變化，與模型組比較，假手術(shù)組、運(yùn)動(dòng)組、中藥復(fù)方組、運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

因此，運(yùn)動(dòng)結(jié)合中藥復(fù)方方法對(duì)去勢(shì)大鼠骨骼肌的影響有改善骨質(zhì)疏松的作用是有顯著作用的。

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