張艷蘭 杜忠東 楊海明 上官文 董 偉 宋銘晶

·論著·

川崎病小鼠腫瘤壞死因子α/核因子κB/基質(zhì)金屬蛋白酶-9通路研究

張艷蘭1,2杜忠東1,2楊海明1,2上官文1,2董 偉3宋銘晶3

目的 通過檢測川崎病(KD)小鼠TNF-α、核因子-κB(NF-κB)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達及活性變化，探討KD的發(fā)病機制。方法 3周齡C57BL/6雄性小鼠60只，分為模型組和對照組，每組各30只。模型組單次腹腔注射0.5 mL干酪乳桿菌細胞壁提取物(LCWE)制備KD模型，對照組注射等量生理鹽水。檢測兩組小鼠注射后14、28和56 d時點外周血TNF-α水平，心臟、冠狀動脈組織NF-κB、MMP-9及其組織抑制物-1(TIMP-1)表達水平，NF-κB 、MMP-9表達活性。觀察小鼠心臟超聲改變，同時行病理學檢查冠狀動脈病變嚴重程度。結(jié)果 ①模型組建模后14 和28 d時點超聲心動圖顯示，冠狀動脈血管內(nèi)膜毛糙，血管壁與血管周圍出現(xiàn)高回聲，部分呈冠狀動脈瘤樣擴張改變；②模型組建模后14 和28 d時點病理學檢查可見冠狀動脈主干周圍管壁腫脹、以淋巴細胞為主的大量炎細胞浸潤，彈力層顯著破壞。模型組建模后14 d時點，血清TNF-α水平明顯高于對照組[(389.3±0.3)vs(18.9±0.3)pg·mL-1，P<0.01]；建模后14和28 d時點心臟及冠狀動脈NF-κBp65蛋白表達水平模型組均顯著高于對照組[14 d：(37.5±9.3)vs(14.6±5.6)μg·L-1,28 d；(57.6±13.7)vs(21.6±6.6)μg·L-1；P均<0.05]；建模后14和28 d時點心臟及冠狀動脈MMP-9/TIMP-1水平模型組顯著高于對照組[14 d：(4.9±1.7)vs(0.5±0.4)，28 d：(12.3±6.9)vs(0.09±0.1)；P均<0.01]。結(jié)論 KD急性期TNF-α等炎性細胞因子分泌，NF-κB活化和MMP-9分泌上調(diào)可能是KD心臟及冠狀動脈炎癥發(fā)生的重要通路。

川崎??； 動物模型； 腫瘤壞死因子α； 核因子-κB； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

川崎病(KD)是一種好發(fā)于5歲以下兒童、病因未明的全身性血管炎綜合征，主要累及中小動脈，特別是冠狀動脈。KD的發(fā)病機制尚未明確，目前認為與KD發(fā)病急性期的免疫系統(tǒng)高度激活導致的血管炎損害有關(guān)。有研究顯示，KD患兒外周血單核細胞NF-κB的表達較正常組升高，伴有冠狀動脈并發(fā)癥時升高趨勢更明顯；外周血可觀察到MMP-9的異常表達和MMP-9/TIMPs比例失調(diào)。提示NF-κB和MMP-9通路可能參與了KD的血管炎癥過程，但臨床研究取材困難，特別是冠狀動脈組織，難以開展進一步的機制研究，且尚未有明確統(tǒng)一的KD動物模型。為此，本研究旨在通過單次腹腔注射干酪乳桿菌細胞壁提取物(LCWE)，誘發(fā)小鼠冠狀動脈炎癥，檢測不同時點TNF-α、NF-κB和MMP-9水平，從而為進一步研究KD的發(fā)病機制提供新思路。

1 方法

1.1 動物 無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠60只，雄性，3～4周齡，體重(10.5±0.8) g。購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(合格證號：SCXK軍2009-0007)，飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院動物研究所。研究獲得首都醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 材料 干酪乳桿菌菌種由加拿大多倫多大學Yeung RS教授惠贈。乳酸菌MRS肉湯培養(yǎng)基、藻紅蛋白標記的大鼠抗小鼠CD34、別藻藍素標記的大鼠抗小鼠CD45、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的大鼠抗小鼠Flk-1(BD公司)；核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶Ⅰ、胰蛋白酶、鼠李糖標準品、十二烷基硫酸鈉、FITC標記血凝素、噻唑藍、纖維連結(jié)蛋白、基質(zhì)膠(Sigma公司)；內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基-2(lonza公司)；DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?Molecular Probes公司)。高分辨小動物超聲儀(加拿大VISUALSONIC公司)；高速冰凍離心機、臺式離心機(美國Eppendorf公司)；超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；-80℃冰箱(美國Cryostar公司)；光學顯微鏡 (美國Olympus公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)；超凈工作臺(蘇州宏瑞凈化科技有限公司)；流式細胞檢測儀(美國BD公司)；酶標儀(芬蘭Labsystems公司)；切片機(德國Leica公司)。

1.3 制備LCWE 參考Yeung等[1]方法行LCWE提取。①將干酪乳桿菌進行復蘇、培養(yǎng)后收集處于對數(shù)生長期的酪乳桿菌，4%SDS進行皂化裂解；②充分洗滌SDS后分別加入RNA酶、Trypsin、DNA酶去除菌液中RNA、蛋白質(zhì)、DNA，并離心收集沉淀物；③將所收集沉淀物超聲波破碎2 h，4℃ 10 000 r·min-1離心1 h，取上清液即為LCWE；④硫酸/苯酚比色法測定LCWE含量，以PBS調(diào)整濃度為1 mg·mL-1。

1.4 小鼠KD模型的建立 將60只3～4周齡C57BL/6雄性小鼠任意分為模型組和對照組，每組各30只。于實驗當天(0 d)模型組腹腔注射0.5 mL LCWE(1 g·L-1)1次，對照組腹腔注射等量PBS液1次。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 飲食、活動、體重和毛發(fā)變化等。

1.5.2 超聲心動圖檢查 于注射LCWE后14、28、56 d時點分別取模型組、對照組10只小鼠麻醉后脫毛，取仰臥位，分別于胸骨旁左室長軸、左室短軸、四腔心切面行超聲檢測，測量小鼠左冠狀動脈內(nèi)徑，采用Vevo770軟件進行測量分析。

1.5.3 TNF-α、NF-κBp65、MMP-9檢測 于上述3個時點心臟超聲后小鼠摘取眼球取血，離心分離血清和血漿采用ELISA方法測定外周血TNF-α含量。之后采用頸椎脫臼法處死小鼠并稱重，后解剖取心臟標本并稱取心臟重量，將其分別置-20℃保存2 h，后置于-70℃保存。取部分心臟標本置于蛋白保護液中，組織裂解提取總蛋白，采用Western-blotting方法測定心臟及冠狀動脈NF-κBp65和MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平；采用凝膠遷移或電泳遷移率檢測方法測定心臟及冠狀動脈NF-κB活性水平；采用明膠酶譜方法測定心臟及冠狀動脈MMP-9表達活性。

1.5.4 病理學檢查 心臟標本光鏡下經(jīng)蘇木精-伊紅染色及彈力纖維蛋白染色，觀察炎細胞浸潤情況及彈力層破壞情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組注射LCWE后1～3 d，小鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)，毛發(fā)紊亂無光澤，易激惹，納食、納水及活動減少，喜抱團，持續(xù)3～4 d后逐漸恢復正常，于建模后第52天死亡2只。對照組無類似表現(xiàn)，無死亡。模型組與對照組建模后14、28、56 d時點體重、心臟重量、心臟重量/體重差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 超聲心動圖檢測 建模后14和28 d時點模型組小鼠超聲心動圖顯示其冠狀動脈血管內(nèi)膜明顯毛糙，血管壁與血管周圍出現(xiàn)高回聲，部分呈冠狀動脈瘤樣擴張改變(圖1A)，左右冠狀動脈均可受累，多為左冠狀動脈主干近端，左側(cè)冠狀動脈內(nèi)徑明顯增寬，顯著高于對照組[14 d：(0.46±0.11)vs(0.32±0.14) mm；28 d:(0.47±0.09)vs(0.36±0.06) mm]，P<0.01。建模后56 d時點模型組超聲心動圖顯示左冠狀動脈內(nèi)徑為(0.43±0.11) mm，較前縮小，部分存在冠狀動脈管腔狹窄、血栓形成(圖1B、C)，與對照組[(0.38±0.02)mm]比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 病理學檢查 建模后14 d時點，模型組小鼠心臟標本冠狀動脈主干周圍可見到管壁腫脹、以淋巴細胞為主的大量炎細胞浸潤(圖2A)；28 d時點模型組小鼠冠狀動脈炎癥細胞浸潤消退，冠狀動脈增寬、動脈中層平滑肌增生明顯(圖2B)；建模后56 d時點，模型組小鼠彈力層可見顯著破壞，彈力層著色淺淡，失去正常的連續(xù)性，同時內(nèi)膜增生明顯(圖2C,D)。對照組冠狀動脈的主干周圍未見明顯炎癥細胞浸潤，彈力層形態(tài)自然，能夠被連續(xù)染色，動脈中層平滑肌未見增生，內(nèi)膜細胞形態(tài)正常(圖2E,F)。

Notes: There was no siginificant difference in birth weight, heart weight and heart weight/body weight ratio at different time points after operation between KD group and control group. 1)n=8

圖1 模型組不同時點冠狀動脈超聲心動圖表現(xiàn)

Fig 1 Ultrasonographic findings of coronary artery of the model group at different time points

Notes A: Echocardiography of model group on day 28 showed coarsed intima of coronary artery after intraperitoneal injections of LCWE, and local coronary artery aneurysm; B, C: Echocardiography of model group on day 56 showed coarsed intima of coronary artery and high density echo images around the coronary artery wall, and luminal stenosis and thrombosis

2.4 血清TNF-α水平比較 表2顯示，建模后14 d時點模型組血清TNF-α水平顯著高于對照組，P<0.01；28和56 d時點,模型組血清TNF-α水平較14 d時點呈顯著下降趨勢,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。

2.5 心臟及冠狀動脈NF-κBp65活性及表達水平檢測 表2顯示，模型組建模后14 d時點，心臟及冠狀動脈NF-κBp65表達含量和蛋白活性明顯高于對照組，P<0.01。28 d時點模型組心臟及冠狀動脈NF-κBp65表達含量和活性仍顯著高于對照組,P<0.01。56 d時點NF-κBp65表達含量和活性較14和28 d時點顯著下降，與對照組差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。

2.6 心臟及冠狀動脈MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平及MMP-9活性檢測 表2顯示，建模后14和28 d時點，模型組小鼠MMP-9、TIMP-1蛋白水平和MMP-9活性較對照組明顯升高，P<0.01；56 d時點模型組MMP-9、TIMP-1蛋白水平和MMP-9活性較14和28 d時點顯著下降，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。建模后14 d時點，MMP-9/TIMP-1比值模型組明顯高于對照組，P<0.05。28 d時點MMP-9/TIMP-1水平較14 d時點升高，且顯著高于對照組，P<0.01；56 d時點，兩組差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 模型組和對照組不同時點冠狀動脈超聲心動圖表現(xiàn)

Fig 2 Ultrasonographic findings of coronary artery in the model and control groups at different time points

NotesCA: coronary artery, AO: aorta. A:14 days after intraperitoneal injections of LCWE，a large number of inflammatory cell infiltration was identified in the coronary artery trunk and branches(HE dyed,×200); B: 28 days following LCWE injection , the infiltration of inflammatory cell was subsided，and the dilation of coronary artery，the hyperplasia of smooth muscle in the film of coronary artery intima could be observed(HE dyed, ×200); C,D: Broken elastin was observed in the murine model of KD group after intraperitoneal injections of LCWE on day 56, and accompanied by the hyperplasia of coronary artery intima (Elastin stain, ×400); E: No significant inflammatory cell infiltration was detected around coronary artery in normal control group(HE dyed, ×200); F: Elastin of coronary artery in normal control group was continuous, no remarkable destruction was observed

3 討論

由于KD多數(shù)預(yù)后良好，患兒的病理標本臨床不易獲得，應(yīng)用KD動物模型成為探索其發(fā)病機制的重要手段。目前已有的KD動物模型包括：犬、兔、小豬和小鼠，其中犬為自然起病，其余為誘導免疫模型。本研究采用課題組前期建立的小鼠KD模型[2]，對不同階段KD小鼠模型行超聲心動圖檢查，對其冠狀動脈損傷情況進行動態(tài)觀測和全面評價，并對其心臟標本進行病理觀察，結(jié)果顯示：模型組小鼠急性期(14和28 d時點)冠狀動脈血管內(nèi)膜明顯毛糙，部分呈冠狀動脈瘤樣擴張改變，多為左冠狀動脈主干近端，左側(cè)冠狀動脈內(nèi)徑增寬；模型組恢復期(56 d時點)超聲心動圖顯示冠狀動脈內(nèi)徑值較前縮小，部分存在冠狀動脈管腔狹窄、血栓形成。這一結(jié)果與KD患兒不同病程的超聲心動圖檢查結(jié)果較為一致[3]。模型組小鼠急性期冠狀動脈主干周圍以淋巴細胞為主的大量炎細胞浸潤，恢復期冠狀動脈炎癥細胞浸潤消退，冠狀動脈增寬、動脈中層平滑肌增生明顯，同時內(nèi)膜增生明顯，其冠狀動脈損傷的病理變化與自然病程狀態(tài)的KD患兒冠狀動脈損傷情況十分相似[4～6]，能很好的模擬KD冠狀動脈損傷的形成過程。

Notes KD groupvscontrol group, 1)P<0.05, 2)P<0.01, 3) the number of mice in model group was 8

單核/巨噬細胞的異?；钴S被認為與血管損害的形成相關(guān)。激活的單核/巨噬細胞可分泌TNF-α、IL-10、IL-6和IFN-γ等炎性細胞因子，同時也通過自分泌方式作用于單核/巨噬細胞本身，釋放炎性介質(zhì)加劇炎性反應(yīng)[7]。疾病早期，動脈壁內(nèi)即出現(xiàn)明顯的水腫和壞死性改變，內(nèi)皮細胞和外膜炎癥最先出現(xiàn)，循環(huán)中內(nèi)皮細胞數(shù)明顯增加[1，2，8]，很快出現(xiàn)動脈全層的炎癥，嚴重損害動脈的支持系統(tǒng)，減弱血管壁完整性，最終血管壁的各層不能分辨，動脈開始擴張，動脈瘤開始形成。Hui等[9]給野生型C57BL/6小鼠腹腔注入LCWE發(fā)現(xiàn)冠狀動脈炎癥，而TNF-α缺陷的TNFRI-/-、TNFRII-/-小鼠不產(chǎn)生冠狀動脈病變；使用TNF-α拮抗劑(etanercept)能保護小鼠不產(chǎn)生冠狀動脈病變。提示，TNF-α是LCWE誘導的小鼠冠狀動脈炎癥發(fā)生發(fā)展中重要的炎癥因子?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅、鈣離子依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，在體內(nèi)主要降解細胞外基質(zhì)(ECM)，在結(jié)締組織的降解和重建、炎癥反應(yīng)和缺氧缺血損傷等過程中起重要作用[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，KD合并冠狀動脈病變患兒MMP-2、MMP-9水平顯著升高[11]，而血管彈性層的破壞與局部MMP-9/TIMP-1比值持續(xù)失衡、MMP-9活性過高有關(guān)[12，13]。本研究表明，KD模型小鼠MMP-9含量在建模后14和28 d時點與對照組比較明顯增高，TIMP-1的表達隨MMP-9的增多而增強，MMP-9/TIMP-1及MMP-9的活性在建模后14和28 d時點較對照組明顯升高，28 d時點的差別尤為明顯。而在建模后56 d時點，MMP-9含量及活性、MMP-9/TIMP-1明顯下降，與對照組間無顯著差異。

MMP-9在KD中上調(diào)的機制目前尚不清楚。Sakata等[14]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)KD患兒血漿或細胞因子處理的臍帶內(nèi)皮細胞有MMP-9 mRNA的表達，認為IL-1β，IL-6,TNF-α可刺激MMP-9的表達。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)與MMP-9的關(guān)系既往多在癌癥細胞研究中被報道。Li等[15]認為IL-23可通過活化NF-κB通路上調(diào)MMP-9的表達，促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移。有研究認為，MMP-9基因啟動子位置及TIMP-1基因5′ 調(diào)節(jié)區(qū)域均存在NF-κB結(jié)合位點?？墒辜毎g黏附分子、誘導型一氧化氮合酶、TNF-α、IL-6、IL-lβ及IL-8等炎癥反應(yīng)相關(guān)炎癥前分子的轉(zhuǎn)錄最大化，進而激發(fā)MMP-9分泌[16]。Ichiyama等[17]發(fā)現(xiàn)KD患兒單核/巨噬細胞內(nèi)NF-κB活性明顯增加，認為NF-κB可能作為始發(fā)炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)在介導血管內(nèi)皮細胞炎性損傷中起重要作用。本研究結(jié)果也顯示，模型組小鼠建模后14 d時點，其心臟及冠狀動脈NF-κBp65及MMP-9表達含量明顯高于對照組，表達含量在建模后28 d時點下降。

綜上所述，在KD急性期，TNF-α等炎性細胞因子分泌、NF-κB活化、MMP-9分泌上調(diào)，TNF-α/NF-κB/MMP-9可能是KD心臟及冠狀動脈炎發(fā)生的重要通路，相關(guān)的發(fā)病機制有待進一步深入研究。

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(本文編輯：丁俊杰)

Experimental study of TNF-α/NF-κB/MMP-9 pathway in a murine model of Kawasaki disease

ZHANG Yan-lan1,2, DU Zhong-dong1,2, YANG Hai-ming1,2,SHANGGUAN Wen1,2, DONG Wei3,SONG Ming-jing3

(1 Department of Cardiology, Beijing Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045；2 Key laboratory of major diseases in childfren, Ministry of education (Capital Medical University)；3 Animal Research Institute, Chinese Academy of Medical Sciences , Beijing 100021, China)

DU Zhong-dong，E-mail:duzhongdong@126.com

ObjectiveTo detect the changes of tumor necrosis factor α (TNF-α), nuclear factor kappa B (NF-κB) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) in acute phase of a murine model of mice with Kawasaki disease, and to investigate the pathogenesis of Kawasaki disease.MethodsLactobacillus casei cell wall extraction (LCWE) was prepared and injected intraperitoneally to 3 weeks old C57BL/6 mice to induce KD. On day 14, 28 and 56, western blotting, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), zymography and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were used to detect serum TNF-α levels, the expression and activation of NF-κBp65 protein in cardiac tissue and coronary artery, the expression of MMP-9 and their inhibitors in cardiac tissue and coronary artery in murine model of KD. At the same time, coronary artery damage was assessed by echocardiography and pathological detection.ResultsEchocardiography identified that coarsed intima of coronary artery and high density echo images around the coronary artery wall were found after intraperitoneal injections of LCWE, and accompanied by local coronary artery aneurysm. Furthermore, swelling of vessal wall and focal inflammatory infiltrate in the murine model of KD group were identified in the coronary artery trunk and branches. Broken elastin was consistently observed in the murine model of KD group. The serum TNF-α levels in the murine model group of KD (389.3±0.3 pg·mL-1on d14) were significantly higher as compared to control group(18.9±0.3 pg·mL-1on D14) (P<0.01). The expression of NF-κBp65 in the model group(37.5±9.3μg·L-1on d14, 57.6±13.7 μg·L-1on d28) was significantly higher than control group (14.6±5.6 μg·L-1on d14, 21.6±6.6 μg·L-1on d28)on day 14 and day 28 following LCWE injection (allP<0.05). The expressions of MMP-9/TIMP-1 in control group (0.5±0.4 on d14, 0.09±0.1 on d28) were significantly lower than the murine model group of KD(4.9±1.7 on d14, 12.3±6.9 on d28) on day 14 and day 28 after LCWE injection (P<0.01).ConclusionUp-regulation of TNF-α/NF-κB/MMP-9 pathway might be an important mechanism of inflammation of heart and coronary arteritis in the acute phase of KD. Further study is needed to clarify this pathogenesis.

Kawasaki disease; Model; Tumor necrosis factor-α; Nuclear factor kappa-B； Matrix metalloproteinases-9

國家自然科學基金面上項目：81274109、30973238；北京自然科學基金B(yǎng)類/北京教育委員會重大科研項目：KZ201010025024；北京市教育委員會科技創(chuàng)新平臺項目：PXM2011_014226_07_000085；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃項目：2009-3-38

1 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院心內(nèi)科 北京，100045；2 教育部兒科重大疾病重點實驗室(首都醫(yī)科大學) 北京，100045；3 中國醫(yī)學科學院動物研究所 北京，100021

杜忠東，E-mail: duzhongdong@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.0.013

2013-11-24

2014-01-07)