熊延連，熊艷蕾，李遙金，唐福州，王若峰，趙押金，王 翔

合理適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動能夠降低多種疾病的發(fā)病率與死亡率［1-2］。而運(yùn)動對相關(guān)心血管因素的改善作用被認(rèn)為是這種保護(hù)作用的基礎(chǔ)。與此相反，運(yùn)動誘導(dǎo)的猝死等疾病被認(rèn)為與多種心血管功能障礙有直接關(guān)系。在運(yùn)動誘導(dǎo)的猝死病例中，往往伴隨著心室纖顫等心律失常的現(xiàn)象［3］。目前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為運(yùn)動導(dǎo)致的冠狀動脈痙攣、血栓等現(xiàn)象所導(dǎo)致的心肌局部供血不足是誘導(dǎo)致命性心律失常的最主要病因［3］。然而，對心血管暢通和氣體運(yùn)輸起著至關(guān)重要作用的紅細(xì)胞的相關(guān)功能是否在運(yùn)動過程中發(fā)生改變，運(yùn)動誘導(dǎo)的多種心血管疾病與紅細(xì)胞功能損傷之間的關(guān)系仍有待研究。

本文通過對不同運(yùn)動條件下細(xì)胞抗氧化能力改變，及不同細(xì)胞組分受氧化損傷程度的檢測評估了自由基誘導(dǎo)的運(yùn)動性氧化應(yīng)激對大鼠紅細(xì)胞的影響。對膜蛋白巰基水平、膜脂質(zhì)過氧化水平和膜蛋白SDS-Page電泳條帶變化進(jìn)行了分析。此外對不同剪切力下紅細(xì)胞變形性（elongation index，EI）進(jìn)行了檢測。通過上述研究為力竭運(yùn)動條件下由于組織局部缺血缺氧導(dǎo)致的休克、死亡等運(yùn)動性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

肝素鈉和PVA購于美國Sigma公司；電泳設(shè)備及相關(guān)耗材購于美國 Bio-rad公司。過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SH及 DMA檢測試劑盒均購于南京凱基生物公司；激光旋轉(zhuǎn)細(xì)胞變形儀LORCA購自荷蘭RR Mechatronics公司；動物跑臺購自淮北正華公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用雄性SD大鼠30只（8周齡，體重200～250 g，第三軍醫(yī)大學(xué)提供），國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。相對濕度45%～55%，室溫（22±5）℃，光照時(shí)間 8：00～20：00的條件下飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，大鼠隨機(jī)分為3組（n＝10）：對照組（control，C），適度運(yùn)動組（moderate running exercise，MRE）和力竭運(yùn)動組（exhaustive running exercise，ERE）。

大鼠跑步運(yùn)動在特制的跑臺上進(jìn)行，動物跑臺由馬達(dá)驅(qū)動，可調(diào)節(jié)跑步速度和坡度。力竭運(yùn)動組大鼠運(yùn)動參照Davies等的運(yùn)動模型［4］，大鼠運(yùn)動的前20 min保持5%的坡度和20 m／min的速度，20 min后調(diào)整為15%的坡度和25 m／min的速度，直至運(yùn)動力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas等的報(bào)道，置于平面后不能完成翻正反射。適度運(yùn)動組大鼠在5%的坡度和20 m／min的速度下跑40 min。對照組大鼠靜坐于跑臺中，不進(jìn)行運(yùn)動。

對照組和運(yùn)動組的大鼠采用心臟取血的方法采集血液。用 PBS洗滌4次然后3 000 r／min離心3 min，獲取紅細(xì)胞，冷凍備用。

1.3 紅細(xì)胞膜蛋白提取

取1ml洗滌后的壓積紅細(xì)胞置于60ml預(yù)冷至4°C的低滲磷酸緩沖液（pH 7.4，7.5mmol／L磷酸緩沖液）中，加入20μmol／L PMSF抑制水解蛋白酶活性，混合均勻后在4°C下破溶1.5 h。然后20 000×g離心20min，洗滌4～5次后此得到白色的 RBC膜，BCA法測定膜蛋白濃度。

1.4 CAT、SOD、GSH、膜蛋白 SH與膜脂 DMA檢測

按照試劑盒操作說明，樣品提取好后，加入DTNB反應(yīng)液，后測412 nm處吸光值。并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞內(nèi)GSH與膜蛋白SH含量。

在紅細(xì)胞裂解液中加全血體積2倍的無水乙醇（2ml），在漩渦振蕩器上充分混勻30 s。再加全血體積2倍的三氯甲烷（2 ml）漩渦振蕩器上充分混勻1min，1 500×g離心10 min。取上層液體（CAT與SOD抽提液），按照試劑盒操作說明檢測 CAT與SOD活力。

膜脂質(zhì)過氧化程度通過TBA試劑盒檢測。取上述裂解液100μl為加樣量，空白組則不加TBA反應(yīng)液，以532 nm處的凈吸光值計(jì)算MDA濃度。脂質(zhì)過氧化程度產(chǎn)物以每毫克血紅蛋白所對應(yīng)的 MDA含量表示。

1.5 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-Page電泳

電泳采用5%～15%的線性梯度膠，還原性電泳樣品經(jīng)含DTT的上樣緩沖液充分還原后上樣，非還原性電泳樣品緩沖液不含DTT，上樣量為5μg。電泳條件為70 V轉(zhuǎn)120 V恒壓電泳。考馬斯亮藍(lán)R250染色，凝膠經(jīng)脫色后用GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。

1.6 紅細(xì)胞變形性檢測

提前打開儀器預(yù)熱30 min，使內(nèi)部溫度達(dá)到37℃后進(jìn)行檢測。取10～20μl壓積RBC，加入1ml 15%PVP溶液（mol wt 360 000；Sigma，St.Louis，MO），混勻。通過激光照射旋轉(zhuǎn)中的紅細(xì)胞，根據(jù)激光衍射圖譜計(jì)算紅細(xì)胞在3 Pa和30 Pa剪切力下的伸長指數(shù)（elongation index，EI）：

公式中L和W分別為衍射圖的長度和寬度。紅細(xì)胞EI值越大，代表它在相同剪切力作用下形變越大，具有更好的變形性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)都從3組或3組以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中得出，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）的形式表示。組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異通過 Origin 7.5軟件的 one-way ANO-VA分析。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動對大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力的影響

我們對不同運(yùn)動條件下大鼠紅細(xì)胞中3種代謝物質(zhì)的檢測結(jié)果表明：與對照組和適度運(yùn)動組相比，力竭運(yùn)動導(dǎo)致大鼠紅細(xì)胞酶類抗氧化物SOD（P＜0.05，表 1）和 CAT（P＜0.01）活性的顯著升高，于此同時(shí)，大鼠紅細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著下降（P＜0.01）。在適度運(yùn)動狀態(tài)下，大鼠紅細(xì)胞抗氧化能力與對照組并無顯著性差異。

Tab.1 Erythrocyte antioxidant parameters in different exercised groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 運(yùn)動對膜脂質(zhì)過氧化和膜蛋白巰基含量的影響

我們通過TBA法檢測膜脂質(zhì)MDA水平，結(jié)果表明，力竭運(yùn)動導(dǎo)致大鼠紅細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著升高（P＜0.01，表 2）。紅細(xì)胞膜蛋白含有豐富的SH，它們對維系RBC膜上眾多酶類和功能蛋白的正常結(jié)構(gòu)功能起到重要作用。與對照組（C）相比，力竭運(yùn)動后紅細(xì)胞膜蛋白SH含量顯著下降（P＜0.05）。在適度運(yùn)動狀態(tài)下，大鼠紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度和膜蛋白巰基含量與對照組相比并無顯著性差異。

2.3 運(yùn)動對大鼠紅細(xì)胞膜蛋白電泳條帶的影響

在非還原性SDS-APGE電泳結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后紅細(xì)胞膜上出現(xiàn)高分子聚合條帶（high molecularweight，HMW），與此同時(shí)，許多小分子條帶豐度顯著降低或消失（圖1箭頭所示）。而在普通運(yùn)動組和對照組HMW的含量非常少。還原性SDSAPGE電泳結(jié)果中各組條帶差異不明顯，力竭運(yùn)動組的HMW條帶基本上消失。

Fig.1 SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis）analyses of erythrocytemembrane proteins in different groups HMW：High molecular weight；C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group.The arrows indicate protein clusters or degradation after exercise-induced oxidative stress

2.4 運(yùn)動對紅細(xì)胞變形性的影響

如圖2所示，在3 Pa（A）和30 Pa（B）條件下，力竭組大鼠紅細(xì)胞變形性（EI分別為0.314±0.013 at 3 Pa and 0.534±0.009 at 30 Pa）顯著低于對照組（0.41±0.01 at3 Pa and 0.571±0.008 at30 Pa；P＜0.05 and P＜0.01，respectively）和適度運(yùn)動組。為了探討蛋白交聯(lián)與運(yùn)動誘導(dǎo)的氧化損傷之間的關(guān)系，我們對各組大鼠紅細(xì)胞在含5.0mmol／L二硫蘇糖醇 （dithiothreitol，DTT）的緩沖液中孵育30min。結(jié)果表明，DTT處理后力竭組紅細(xì)胞變形性出現(xiàn)顯著回復(fù)（P＜0.05）。在適度運(yùn)動狀態(tài)下，大鼠紅細(xì)胞脂變形性與對照組相比并無顯著性差異。

Fig.2 RBC deformability as reflected by the elongation index in different groups under shear stressof3 Pa（A）and 30 Pa（B）C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

3 討論

運(yùn)動，尤其力竭運(yùn)動過程中機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致包括肌肉、心血管損傷在內(nèi)的多種運(yùn)動性氧化應(yīng)激反應(yīng)［5-7］。在對運(yùn)動性氧化損傷的研究過程中，紅細(xì)胞因其在機(jī)體內(nèi)清除自由基、維系氧化還原平衡過程中所起的重要作用逐漸受到人們的關(guān)注［8-10］。研究力竭運(yùn)動過程中紅細(xì)胞抗氧化、清除自由基能力的變化，自身受到氧化損傷程度的變化，以及氧化應(yīng)急條件下紅細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)和攜氧功能的改變將對運(yùn)動誘發(fā)的休克、缺氧損傷、紅細(xì)胞凋亡等多種生理和病理現(xiàn)象的探索提供重要的理論依據(jù)。

紅細(xì)胞內(nèi)擁有包括酶類和非酶類抗氧化物在內(nèi)的抗氧化體系。正常情況下，它們協(xié)同作用能夠清除包括 H2O2、O·2-和 OH·在內(nèi)的絕大部分自由基，維持細(xì)胞的氧化還原平衡。本實(shí)驗(yàn)中，力竭運(yùn)動后大鼠紅細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著降低，表明伴隨著運(yùn)動強(qiáng)度的增加紅細(xì)胞通過GSH維系氧化還原平衡的能力逐漸減弱。這種削弱一方面是由于清除自由基過程中GSH的大量消耗；另一方面，由于紅細(xì)胞內(nèi)GSH-GSSH循環(huán)體系的還原力主要來自于糖代謝HMP途徑產(chǎn)生的NADPH。由此推測，在力竭運(yùn)動過程中紅細(xì)胞的能量代謝途徑也可能發(fā)生相應(yīng)改變。

RBC膜上有很多蛋白和酶類以半胱氨酸殘基作為必須氨基酸，自由基攻擊導(dǎo)致的SH氧化交聯(lián)可損傷上述蛋白及酶的功能，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能紊亂。本研究室的前期工作表明，人紅細(xì)胞膜蛋白SH水平與RBC粘彈性呈正相關(guān)關(guān)系［11］。由此可見，紅細(xì)胞膜蛋白SH水平在維系RBC功能的過程中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，力竭運(yùn)動后大鼠紅細(xì)胞膜SH含量顯著降低，表明在力竭運(yùn)動過程中自由基攻擊導(dǎo)致膜蛋白SH交聯(lián)產(chǎn)生-SS-。SH含量的降低一方面表明紅細(xì)胞膜蛋白通過膜上大量巰基集團(tuán)抵抗氧化損傷能力的降低；另一方面，也意味著紅細(xì)胞膜蛋白已經(jīng)受到ROS攻擊而發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變。此外，力竭運(yùn)動后大鼠紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平高出對照組和適度運(yùn)動組一倍以上。表明在力竭運(yùn)動過程中大鼠紅細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生了嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。由于膜流動性與膜脂肪酸的飽和程度密切相關(guān)，PUFA的氧化將導(dǎo)致紅細(xì)胞流動性的下降。此外，脂質(zhì)過氧化過程中生成的ROS將誘導(dǎo)紅細(xì)胞膜組分（如膜酶和膜骨架蛋白）的進(jìn)一步損傷。

正常情況下，由于體內(nèi)存在一定數(shù)量的衰老紅細(xì)胞，在非還原性電泳條帶中都會有少量高分子聚合物條帶的出現(xiàn)。然而，在力竭運(yùn)動組電泳條帶中可明顯地看到HMW條帶的出現(xiàn)，而且伴隨著包括Band 3在內(nèi)的多種小分子條帶的減弱與消失。而在含有DTT的還原性SDS-PAGE電泳中，力竭運(yùn)動組HMW條帶顯著的減弱。由于DTT常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。這意味著力竭運(yùn)動所誘導(dǎo)的蛋白聚集主要是通過-S-S-鍵連接。-SH的氧化交聯(lián)會對紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和多種代謝功能造成嚴(yán)重?fù)p傷。有研究表明，紅細(xì)胞膜蛋白-SH水平與細(xì)胞粘彈性呈正相關(guān)關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中，力竭組紅細(xì)胞-SH的大量減少，誘導(dǎo)細(xì)胞膜蛋白交聯(lián)的同時(shí)紅細(xì)胞變形性與攜氧功能都出現(xiàn)了顯著地降低。而在對細(xì)胞進(jìn)行體外還原處理后，膜蛋白交聯(lián)程度明顯減弱，與此同時(shí)，紅細(xì)胞的變形能力與攜氧功能都出現(xiàn)了明顯的恢復(fù)。由此可見，由自由基攻擊所引發(fā)的膜蛋白巰基交聯(lián)所導(dǎo)致的多種膜蛋白的損傷是力竭運(yùn)動誘導(dǎo)的紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能性損傷的重要原因。

紅細(xì)胞的變形能力是影響血液流動和粘滯性的最主要因素［12］。紅細(xì)胞良好的變形性是保障機(jī)體微循環(huán)暢通，生理功能健全，以及維持生命運(yùn)動的基礎(chǔ)。在多種生理病理情況下，由紅細(xì)胞變形性下降誘導(dǎo)的微循環(huán)障礙，尤其是在代謝活躍的器官（心、腦、肺）這種影響更加明顯。洪平等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適度運(yùn)動條件下模擬平原訓(xùn)練和高原訓(xùn)練都能提高SD大鼠RBC變形性［13，14］。本實(shí)驗(yàn)中，由于進(jìn)行的是一次性運(yùn)動，適度運(yùn)動組大鼠紅細(xì)胞變形性并未發(fā)現(xiàn)顯著提升。此前有研究表明，耐力運(yùn)動可降低血管一氧化氮合酶活性，對動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能產(chǎn)生有益影響［15］。而本實(shí)驗(yàn)中，力竭運(yùn)動后大鼠RBC變形性顯著下降，這與之前的研究結(jié)果相吻合［16］。此外，為了揭示力竭運(yùn)動誘導(dǎo)紅細(xì)胞變形性下降的原因，本研究對各組紅細(xì)胞進(jìn)行了DTT處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后紅細(xì)胞變形性出現(xiàn)明顯的恢復(fù)。由于DTT具有極強(qiáng)的還原性，常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵，對紅細(xì)胞的膜蛋白巰基具有極強(qiáng)的保護(hù)作用。這也就意味著，力竭運(yùn)動過程中紅細(xì)胞變形性的降低與氧化應(yīng)激引起的膜蛋白巰基交聯(lián)有密切關(guān)系。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動能夠誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響紅細(xì)胞變性能力，成為力竭運(yùn)動誘導(dǎo)的多種心腦血管疾病發(fā)生的潛在致病因素。本研究對力竭條件下由組織局部缺血缺氧所導(dǎo)致的休克、死亡等運(yùn)動性疾病的研究提供了理論依據(jù)。

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