朱再滿，華田苗，周鴻銘，潘群皖，李 晶，李 敏

藥物成癮（drug addiction）是一種心理和身體依賴性的慢性復(fù)發(fā)性疾?。?］。目前認(rèn)為藥物成癮的主要神經(jīng)基礎(chǔ)是腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）、伏隔核（NAc）、前額葉皮質(zhì)（PFC）、底外側(cè)杏仁核（BLA）等構(gòu)成的中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，與藥物成癮密切相關(guān)［2］。Olds［3］提出的“VTA-NAc-PFC獎(jiǎng)賞環(huán)路中，VTA及其投射區(qū)NAc是其主要的神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)，天然的獎(jiǎng)賞性刺激都是通過作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，引起NAc內(nèi)多巴胺（dopamine，DA）釋放增多而產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)。故NAc是產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)的關(guān)鍵核團(tuán)，在阿片類藥物依賴形成機(jī)制中起著重要作用。

時(shí)間--頻率分析顯示，持續(xù)的新異刺激可導(dǎo)致人NAc腦電頻譜發(fā)生變化，以θ波、β波變化最為顯著［4］。麻醉和睡眠時(shí)相亦會(huì)影響大鼠NAc腦電活動(dòng)頻率的分布［5］。藥物依賴個(gè)體NAc胞外腦電生理記錄研究較少，且方法僅為動(dòng)物麻醉狀態(tài)的有線在體記錄，海洛因依賴個(gè)體清醒活動(dòng)狀態(tài)NAc放電的無線遙測未見報(bào)道。本研究采用腦電無線遙測技術(shù)，結(jié)合條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）系統(tǒng)，胞外記錄海洛因誘導(dǎo)CPP大鼠NAc腦電活動(dòng)對海洛因的電生理反應(yīng)性，探討其與大鼠位置偏愛及其覓藥行為之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

成年清潔級SD大鼠（南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供，合格證號(hào)：scxk蘇2007-0001）20只，體重290～320 g，雌雄不拘，常規(guī)飼養(yǎng)（室溫24℃±2℃，12 h光照，配備充足的嚙齒類飼料及飲用水）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠NAc電極埋藏 1%戊巴比妥鈉腹腔注射（ip，50mg／kg體重），行雙側(cè) NAc電極埋藏手術(shù)，術(shù)中篩選顱骨前囟至人字縫距離大于9 mm的大鼠做電極埋藏。根據(jù)Paxinos大鼠腦立體定位圖譜［6］，于顱骨表面（A：2.0mm，L：1.7mm，H：6.9mm）牙科鉆鉆孔，雙側(cè)置入鎳鉻絲電極。人字縫前兩側(cè)固定細(xì)螺桿，頭皮下組織埋藏接地電極，自凝牙科水泥固封。術(shù)后恢復(fù)5 d，前3天連續(xù)肌注40萬單位青霉素以防感染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉、取腦，作快速冷凍組織切片，檢查埋藏電極的位置，如位置偏離NAc則舍去所得數(shù)據(jù)。

1.2.2 海洛因誘導(dǎo)CPP大鼠模型制作、確認(rèn)及海洛因戒斷 大鼠埋藏電極后，設(shè)置海洛因誘導(dǎo)組和對照組各10只，分別編號(hào)。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放入CPP系統(tǒng)黑白箱中自由習(xí)服，每天上午9∶00開始，持續(xù)45 min，連續(xù)3 d。習(xí)服結(jié)束后，做CPP測試，每只大鼠測試5次，每次15min，間隔1 h，觀察大鼠在CPP系統(tǒng)中的運(yùn)動(dòng)情況，用JLBehv條件性位置偏愛視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)每只大鼠黑、白箱中的停留時(shí)間、百分比及活動(dòng)度。本實(shí)驗(yàn)中大鼠普遍偏愛黑箱，故選白箱為伴藥箱，偏愛黑箱（在黑箱中平均停留時(shí)間超過540 s，即總時(shí)間900 s的60%以上）的大鼠進(jìn)入下一階段實(shí)驗(yàn)。

將海洛因誘導(dǎo)組大鼠趕至CPP系統(tǒng)白箱（伴藥箱）中給予海洛因（安徽省公安廳提供）SC，第1天總量0.5 mg／kg，以后每天注射 2次（AM 9∶00，PM 3∶00），每次均遞增 0.25 mg／kg。給藥后，將大鼠置于伴藥箱中45 min。自第2天開始，每天上午給藥前，測定海洛因誘導(dǎo)組CPP相關(guān)數(shù)據(jù)，每次15 min。對照組注射等體積生理鹽水，方法同海洛因誘導(dǎo)組。

大鼠連續(xù)注射藥物5 d后，每日將測得的大鼠伴藥箱停留時(shí)間與給藥前數(shù)據(jù)個(gè)體自身對照分析，伴藥箱停留時(shí)間超過給藥前50%為位置偏愛建模成功。

1.2.3 大鼠戒斷癥狀觀察 造模結(jié)束并完成即刻狀態(tài)NAc腦電記錄后，停止注射海洛因和NS，使大鼠進(jìn)入自然戒斷狀態(tài)，觀察大鼠的戒斷癥狀。連續(xù)4 d，應(yīng)用柳田知司評分標(biāo)準(zhǔn)［7］，對大鼠的戒斷癥狀進(jìn)行評分。間斷咬牙及輕度煩躁各0.5分，觸碰激惹、間斷性意向性震顫、輕度流涎各1分，異常姿勢、靠近激惹、連續(xù)性意向性震顫、明顯流涎各2分，流淚、軟便各4分，腹瀉、大便不成形8分，體重減輕2%～4%為5分、減輕4%～6%為10分、減輕6%～8%為15分。計(jì)算每只大鼠戒斷癥狀的分值總和。

1.2.4 大鼠兩側(cè)NAc腦電活動(dòng)的無線遙測 通過BW-200生理無線遙測系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），記錄各組大鼠兩側(cè)NAc的腦電活動(dòng)。將微型無線遙測發(fā)射端子固定于大鼠背部，打開發(fā)射端子磁開關(guān)，輸入電極分別連接地電極和左、右側(cè)NAc埋藏電極，發(fā)射端子自動(dòng)采集和發(fā)射NAc腦電活動(dòng)活動(dòng)，經(jīng)智能接收機(jī)解碼，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中心機(jī)輸送至電腦，利用系統(tǒng)服務(wù)軟件記錄和處理腦電信號(hào)。給藥前狀態(tài)為造模前大鼠于白箱中記錄，即刻狀態(tài)為CPP建模成功大鼠給藥10 min后白箱中記錄，戒斷狀態(tài)取CPP大鼠戒斷癥狀評分最高、戒斷癥狀明顯時(shí)記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

大鼠CPP數(shù)據(jù)通過CPP系統(tǒng)軟件記錄，并繪制大鼠運(yùn)行軌跡圖。NAc腦電活動(dòng)遙測記錄和快速傅里葉分析通過BW-200無線遙測系統(tǒng)軟件完成，原始遙測腦電時(shí)間軸壓縮20倍，間隔隨機(jī)取樣，自動(dòng)生成各頻率腦電百分比，腦電頻率為δ波（0.5～4）Hz，θ波（4～8）Hz，α1波（8～11）Hz，α2波（11～13）Hz，β1波（13～18）Hz，β2波（18～30）Hz，分段統(tǒng)計(jì)各頻率腦電百分比。所得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同狀態(tài)下NAc腦電頻率比例顯著性檢驗(yàn)用單因素方差（ANOVA）分析，并做方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 海洛因誘導(dǎo)大鼠白箱CPP的建立

習(xí)服后的大鼠分別做CPP測試，每只大鼠測試5次，每次15 min，記錄大鼠黑白箱停留時(shí)間及百分比，描繪運(yùn)行軌跡。已編號(hào)的海洛因誘導(dǎo)組大鼠和對照組分別與實(shí)驗(yàn)前比較，以白箱停留時(shí)間較給藥前大于50%為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示海洛因誘導(dǎo)組大鼠白箱給藥5 d后，部分大鼠即可產(chǎn)生CPP，給藥8 d后，大鼠白箱CPP顯著；部分大鼠10 d以后才出現(xiàn)。軌跡圖顯示CPP大鼠白箱中活動(dòng)時(shí)間明顯延長，活動(dòng)范圍增大（圖1），其中左箱為黑箱，右箱為白箱（伴藥箱）。本研究所采用的海洛因劑量能使所有模型組大鼠都產(chǎn)生依賴性，且未發(fā)生過量中毒死亡情況。對照組大鼠未出現(xiàn)白箱CPP。

Fig.1 Trajectory of rats in the CPP system A：Before drug；B：Four days after drug；C：Eight days after drug

2.2 海洛因誘導(dǎo)CPP大鼠戒斷癥狀評價(jià)分析

海洛因依賴建模之前，大鼠均未出現(xiàn)戒斷癥狀。建模成功后突然停止注射海洛因和NS，模型組大鼠出現(xiàn)煩躁不安、異常姿勢、意向性震顫、激惹、咬牙、流涎、流淚、腹瀉等戒斷癥狀；對照組未出現(xiàn)上述戒斷癥狀。戒斷第1～4天時(shí)，模型組大鼠戒斷癥狀評分明顯高于對照組（P＜0.01）。與建模前相比，模型組大鼠戒斷癥狀評分顯著增加（P＜0.01），其中戒斷第2天時(shí)戒斷癥狀最為顯著（表1）。大鼠海洛因戒斷癥狀評分比較的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性。**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs beforemodeling

Tab.1 Evaluating on heroin withdrawal symptoms of rats（ˉx±s，n＝10）

2.3 海洛因誘導(dǎo)白箱CPP大鼠NAc腦電活動(dòng)

2.3.1 大鼠NAc腦電活動(dòng)腦電圖描記 在白箱中分別記錄海洛因誘導(dǎo)組大鼠NAc給藥前、給藥后即刻和藥物戒斷3個(gè)時(shí)期的自發(fā)腦電（圖2），每個(gè)腦電圖按時(shí)間軸壓縮20倍截選10 s。記錄的腦電圖波形穩(wěn)定，無干擾波，周期明顯。腦電圖顯示，給藥后即刻期腦電波（圖2B）頻率明顯低于給藥前期和戒斷期，且腦電波時(shí)程較長，波幅較大。

Fig.2 EEG of the NAc in different stages A：EEG recorded before drug；B：EEG recorded immediately after drug；C：EEG in withdrawal stage

2.3.2 大鼠NAc腦電活動(dòng)頻率分析 記錄的NAc腦電經(jīng)快速傅立葉變換后，獲取各頻段腦電百分比（圖3）。結(jié)果顯示，各期δ波百分比最大，α2波百分比最小，各期不同頻段腦電的分布梯度相同。大鼠即刻狀態(tài)NAc腦電發(fā)放較給藥前明顯變化，δ波比例顯著增大（P＜0.01），β1波、β2波比例顯著減?。≒＜0.01）；戒斷狀態(tài)與給藥前比較，δ波比例增大（P＜0.05），α1波比例減?。≒＜0.01），其余頻段無顯著差異；即刻狀態(tài)較戒斷狀態(tài)δ波（P＜0.05）、α1波（P＜0.01）比例較大，β1波、β2波比例明顯較低（P＜0.01）；即刻狀態(tài)的δ波、β1波、β2波較其他狀態(tài)皆有顯著差異，其中δ波比例顯著增大，β1波、β2波比例顯著減?。≒＜0.01），即刻狀態(tài) NAc腦電總體趨勢是低頻腦電比例較大，高頻腦電比例較小。

Fig.3 Frequency spectrum of rat NAc EEG（ˉx±s，n＝10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs immediately after drug； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs before drug；△P＜0.01 vs before drug

2.3.3 大鼠NAc腦電波幅 對無線遙測系統(tǒng)記錄的NAc自發(fā)腦電幅度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，給藥前自發(fā)腦電平均波幅最小，且和其余各組差異顯著（P＜0.01），即刻狀態(tài)平均波幅較高，且明顯高于戒斷狀態(tài)（P＜0.01，圖 4）。

Fig.4 Wave amplitude of rat NAc EEG**P＜0.01 vs before drug；＃＃P＜0.01 vs immediately after drug

3 討論

腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)中，阿片類藥物通過增強(qiáng)NAc中DA能神經(jīng)元的功能活動(dòng)，引起NAc內(nèi)DA釋放增加，亦可降低VTA中GABA能神經(jīng)元活性，減弱其對NAc內(nèi)DA能神經(jīng)元的緊張性抑制，從而產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)［8，9］。毀損伏隔核可減輕嗎啡依賴大鼠的戒斷癥狀和位置偏愛效應(yīng)［10］，向伏隔核內(nèi)注入阿片受體激動(dòng)劑可使伏隔核內(nèi)DA含量升高，并產(chǎn)生位置偏愛效應(yīng)［11］，提示NAc是參與阿片類藥物依賴形成的重要核團(tuán)，但藥物依賴不同時(shí)期內(nèi)NAc神經(jīng)元腦電活動(dòng)的變化尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用腦電無線遙測技術(shù)，觀察到大鼠在海洛因給藥前、即刻狀態(tài)、戒斷狀態(tài)的NAc腦電活動(dòng)頻率分布及波幅存在差異，提示海洛因?qū)Υ笫驨Ac腦電活動(dòng)形態(tài)會(huì)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)采用的植入式無線遙測EEG記錄技術(shù)，最大優(yōu)勢在于可以同步監(jiān)測動(dòng)物的EEG、活動(dòng)度和行為學(xué)指標(biāo)的變化，從而可以對EEG與行為進(jìn)行同步研究，減少了動(dòng)物受束縛的限制，可以使動(dòng)物的應(yīng)激狀態(tài)最小化，能更好地反映動(dòng)物的真實(shí)狀態(tài)。植入式遙測EEG記錄技術(shù)減少了動(dòng)物在急性和慢性研究中受金屬絲感染的機(jī)率，提高了EEG的質(zhì)量，且持續(xù)記錄的可控性強(qiáng)，可從幾分鐘至幾個(gè)月，尤其適用于慢性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［12］。

本研究利用CPP系統(tǒng)，成功建立海洛因誘導(dǎo)CPP大鼠模型，因位置偏愛箱為相對封閉狀態(tài)，大鼠的行為數(shù)據(jù)皆可實(shí)時(shí)被記錄和分析，模型可信度較高。大鼠位置偏愛出現(xiàn)時(shí)間從5 d到10 d，顯示不同個(gè)體產(chǎn)生藥物依賴的差異性。各狀態(tài)腦電的頻率分布均呈現(xiàn)相同梯度，其中δ波比例皆最大，α2波比例皆最小，表明了腦電信號(hào)的相對穩(wěn)定性。有報(bào)道認(rèn)為大鼠急性給予嗎啡后，嗎啡依賴組大鼠伏隔核放電平均頻率降至2 Hz甚至2 Hz以下［13］，與本研究中大鼠給藥后即刻期δ波比例較給藥前顯著升高（達(dá)45.58%）的結(jié)果一致，表明給藥后有較多的NAc神經(jīng)元出現(xiàn)同步化活動(dòng)，與慢波睡眠期大鼠NAc的腦電活動(dòng)特征相似［5］。戒斷期的β2、β2波比例與給藥后即刻期有顯著差異，即低頻腦電波比例減少，而高頻腦電波比例又出現(xiàn)回升，并與給藥前的無顯著差異，提示海洛因戒斷期大鼠伏隔核神經(jīng)元活動(dòng)的去同步化增強(qiáng)。因此，NAc神經(jīng)元活動(dòng)的同步化程度可能與海洛因依賴具相關(guān)性，這種同步化活動(dòng)是否與NAc內(nèi)DA或GABA遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

治療藥物成癮和依賴是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題。本研究發(fā)現(xiàn)，海洛因依賴伏隔核神經(jīng)元放電形式、頻率發(fā)生了改變，表明海洛因依賴對大鼠伏隔核神經(jīng)元活動(dòng)有影響。有形態(tài)學(xué)研究表明，電鏡下海洛因依賴大鼠伏隔核神經(jīng)元可見變性、凋亡，海洛因依賴可使伏隔核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［14］。海洛因依賴對腦內(nèi)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的相關(guān)遞質(zhì)的表達(dá)可能也有影響，尤其是VTA-NAc-PFC環(huán)路中相關(guān)遞質(zhì)的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。鑒于NAc在藥物依賴中的重要作用，有研究用伏隔核毀損術(shù)毀損伏隔核的核心部以抑制大鼠海洛因自我給藥的建立［15，16］，并有顯著的效果。但因靶點(diǎn)毀損是不可逆的，伏隔核本身又與自然獎(jiǎng)賞等人類本能行為密切相關(guān)，毀損后的心理學(xué)改變及長期影響亦需要研究。所以，我們擬借鑒電針對海洛因成癮大鼠的行為干預(yù)［17］及腦深部電刺激（deep brain stimulation，DBS）在治療癲癇［18］、帕金森癥［19］等疾病中的應(yīng)用，利用 NAc植入電極電刺激回輸技術(shù)，探索治療藥物依賴的新途徑。

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