錢(qián) 虹，楊鈞杰，潘定一，唐文濤，許可佳，齊敏友

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病嚴(yán)重而常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，同時(shí)也是糖尿病患者中最常見(jiàn)的微血管病變之一［1］。大量研究表明：血流動(dòng)力學(xué)途徑、纖維化和炎癥因子、激酶途徑以及氧化應(yīng)激介質(zhì)等在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［2］，其中纖維化因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）受到廣泛關(guān)注［3］。淫羊藿總黃酮（total flavonoids of epimedium，TFE）是從淫羊藿莖葉中提取的黃酮類(lèi)成分，是淫羊藿的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，TFE對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等疾病均有一定作用［4］，同時(shí)也表現(xiàn)出較好的降血糖作用，但 TFE在DN發(fā)展過(guò)程中是否可以通過(guò)抑制腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)從而抗腎臟纖維化尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）建立糖尿病大鼠腎病模型，研究TFE對(duì)糖尿病大鼠腎病的作用及其機(jī)制，為其臨床新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 SD大鼠，體重180～200 g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）-2008-0033。

1.1.2 藥物與主要試劑 淫羊藿總黃酮由西安小草植物科技有限公司提供；鏈脲佐菌素，由Sigma公司生產(chǎn)；SOD、MDA、BUN、Cr、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，均由南京建成生物工程有限公司提供；兔抗大鼠TGF-β1抗體，由博士德生物技術(shù)有限公司提供；兔抗Envision抗體，由DAKO公司提供。

1.1.3 儀器 血糖測(cè)試儀（美國(guó)強(qiáng)生）；AL204型電子天平（Made by Mettler-Toledo Group）；高速冷凍離心機(jī)（Biofuge stratos，德國(guó) Thermo）；MICROM輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（HM325型，德國(guó)美康）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 雄性SD大鼠，分籠飼養(yǎng)。禁食不禁水12 h后，一次性尾靜脈注射 STZ（40 mg／mg），STZ以檸檬酸緩沖液溶解（pH 4.5），現(xiàn)配現(xiàn)用。72 h后，取尾靜脈血測(cè)血糖，兩次血糖均高于16.7mmol／L者視為糖尿病大鼠模型。大鼠隨機(jī)分為3組（n＝10）：對(duì)照組、模型組、TFE組。造模第 5周開(kāi)始灌胃，TFE以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配成混懸液，給藥劑量 100 mg／（kg·d），對(duì)照組與模型組給予相同體積的0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)8周。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后，空腹12 h，尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定各組血糖。內(nèi)眥取血，靜置，4℃離心（3 500 r／min，10 min），取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血尿素氮和肌酐含量。處死大鼠，快速取出腎臟，剔除周?chē)Y(jié)締組織和脂肪，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱(chēng)取腎臟質(zhì)量，根據(jù)末次體重計(jì)算腎臟臟器系數(shù)（腎臟重／體重）。取適量右側(cè)腎臟組織，冷生理鹽水冰浴條件下制成10%勻漿液，4℃離心（3 000 r／min，10 min），取上清液，-20℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)超氧化物歧酶（superoxide dismutase，SOD）活 性 和 丙 二 醛 （malondialdehyde，MDA）含量。

1.2.3 組織學(xué)檢測(cè) 左側(cè)腎臟組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)Masson染色后于光鏡下觀察腎小球的病理改變和膠原纖維增生情況。

1.2.4 免疫組化檢測(cè) 采用免疫組化 Envision法檢測(cè)TGF-β1在各組大鼠腎組織的分布和表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)半定量方法參考本實(shí)驗(yàn)室前期的研究［5］，取 10個(gè)視野點(diǎn)（100倍），取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并作組間倆倆比較。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病大鼠一般體征和腎臟臟器系數(shù)的影響

對(duì)照組大鼠飲食及尿量正常，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，毛色潔白有光澤，體重穩(wěn)定增加。模型組大鼠表現(xiàn)為多飲、多食、多尿癥狀，體重逐漸減輕，腎臟臟器系數(shù)顯著增大（P＜0.01）。TFE組大鼠一般體征與對(duì)照組接近，腎臟系數(shù)得到改善（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Body weight，ratio of kidney／body weight improved after interventions with TFE for 8 weeks（ˉx±s，n＝10）

2.2 淫羊藿總黃酮對(duì)大鼠血糖和腎功能BUN、Cr的影響

模型組大鼠血糖、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）水平較對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01），TFE組血糖略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），BUN和 Cr含量明顯低于模型組（P＜0.05，表2），表明淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病腎功能有明顯改善作用。

Tab.2 Comparison of blood glucose，BUN and Cr（ˉx±s，n＝10）

2.3 淫羊藿總黃酮對(duì)糖尿病大鼠腎組織SOD活力和MDA含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織中SOD活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），表明大鼠腎組織中存在過(guò)度的氧自由基，機(jī)體抗氧化能力下降。TFE組上述狀況得以改善（P＜0.05，P＜0.01，表 3），提示淫羊藿總黃酮某種程度上能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。

Tab.3 Comparison of SOD and MDA（ˉx±s，n＝10）

2.4 Masson染色法觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)

Masson圖像染色光鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組腎小管細(xì)胞排列整齊，僅可見(jiàn)少量膠原纖維分布。模型組腎小管細(xì)胞排列紊亂，腎小管-間質(zhì)細(xì)胞之間、血管周?chē)z原纖維顯著增多，分布紊亂呈藍(lán)色。TFE組較模型組有所改善，膠原纖維分布正常，血管周?chē)?、腎小管-間質(zhì)細(xì)胞間僅有少量淺藍(lán)色著色（圖1）。

Fig.1 Expression of collagen protein in renal tissue of rats（Masson×100）A：Control group；B：Modelgroup；C：TFE group；TFE：Total flavonoids of epimedium

2.5 腎臟組織中TGF-β1表達(dá)的變化

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組部分腎小管間質(zhì)僅有微量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）陽(yáng)性棕黃色顆粒；模型組（0.39±0.06）腎小管系膜區(qū)、基底膜可見(jiàn)大量棕褐色陽(yáng)性顆粒，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與對(duì)照組（0.16±0.03）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；TFE組（0.25±0.02）較腎小管間質(zhì) TGF-β1陽(yáng)性著色明顯減輕（P＜0.01，圖 2）。

Fig.2 Expression of TGF-β1 in renal tissuesof rats（Immunohistochemical×100）A：Control group；B：Model group；C：TFE group；TFE：Total flavonoids of epimedium**P＜0.01 vs A；＃＃P＜0.01 vs B

3 討論

糖尿病腎病臨床表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率降低、蛋白尿、動(dòng)脈血壓升高、體液潴留等癥狀，最終導(dǎo)致腎功能衰竭，是糖尿病患者死亡的重要原因［6］。新近研究表明，DN源于高血糖下的代謝紊亂，導(dǎo)致纖維化因子和炎癥因子合成釋放增加、氧化應(yīng)激增強(qiáng)導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變［7］。本實(shí)驗(yàn)以STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型，腎功能降低，腎臟抗氧化能力減弱，Masson染色顯示腎臟結(jié)構(gòu)排列紊亂，腎小球和腎小管纖維化明顯，表明糖尿病腎病模型建立成功。TFE能夠提高糖尿病腎病大鼠腎組織抗氧化能力，減輕腎組織纖維化，對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：糖尿病腎病乃糖尿病日久傷陰耗氣，使腎體受損，腎用失司所致［8］。治療上以補(bǔ)腎活血、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀等為主。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿的全草，是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中的一味補(bǔ)益中藥，具有滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨等功效，是中醫(yī)藥醫(yī)治DN的常用處方之一。TFE是從其莖葉中提取的主要有效成分，作為一種植物黃酮，具有較好的抗氧化活性，推測(cè)其能保護(hù)腎臟，延緩DN進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)觀察到TFE對(duì)糖尿病大鼠血清尿素氮和肌酐具有明顯的改善作用，表明其可保護(hù)糖尿病大鼠腎功能；此外，我們對(duì)大鼠腎組織中MDA含量和SOD活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TFE治療，糖尿病大鼠腎組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物含量明顯減少，抗氧化酶SOD活性有顯著提高，提示TFE能夠提高經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激水平，這與我們的推測(cè)相一致。此外，TFE組血糖較模型組并未有明顯降低，表明TFE可能是通過(guò)提高抗氧化能力而不是通過(guò)降低血糖保護(hù)糖尿病大鼠腎臟。

腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）進(jìn)行性積聚是DN的重要特征，也是腎小球硬化、腎小管壞死和腎功能衰竭的關(guān)鍵［9］。在這一過(guò)程中，TGF-β1參與并發(fā)揮重要作用，其通過(guò)破壞ECM的合成與降解平衡造成ECM過(guò)度積聚。一方面，TGF-β1可上調(diào)纖溶酶原激活物抑制物-1（plaminogen activator inhibitor-1，PAI-1）表達(dá)，從而抑制纖溶酶原激活物對(duì)纖溶酶原的活化，進(jìn)而使ECM降解減少。另一方面，TGF-β1可直接促進(jìn)腎小管細(xì)胞、系膜細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成膠原Ⅰ、層粘連蛋白和纖維連接蛋白［2］，促進(jìn)ECM積聚；此外，TGF-β1也可上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），間接增加 ECM合成。兩方面共同作用，最終加劇DN病情。本實(shí)驗(yàn)Masson染色、TGF-β1免疫組化及半定量結(jié)果顯示，糖尿病大鼠經(jīng)TFE治療后，腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低，纖維化情況明顯得到改善，提示TFE可能通過(guò)上述機(jī)制減輕糖尿病腎臟損傷。

綜上所述，高水平的氧化應(yīng)激和TGF-β1蛋白表達(dá)加劇DN過(guò)程，TFE能較好減輕DN引起的腎臟損傷，其可能機(jī)制包括增加機(jī)體抗氧化能力和下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)而不是通過(guò)降低血糖。由于目前對(duì)DN缺乏有效的治療手段，因此研究TFE保護(hù)DN大鼠腎臟的作用和機(jī)制，對(duì)開(kāi)發(fā)中藥治療DN具有重要意義。

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