吳勤學 王洪生

·綜述·

麻風免疫診斷進展

吳勤學 王洪生

本文系統(tǒng)地復習了麻風桿菌(ML)基因組詮釋前后的免疫診斷研究，詮釋前的研究主要包括以PGL－I為基礎的血清學實驗和以蛋白抗原為基礎的血清學實驗，詮釋后的研究主要介紹了培養(yǎng)濾液蛋白CFP－10和早期分泌抗原在免疫診斷中的應用，還介紹了特異性引起T細胞反應的肽類的研究。

麻風桿菌； 免疫診斷

目前早診斷與早治療依然是控制麻風的基石，涂片查菌陽性率低和缺乏特異性延遲了麻風早期診斷及治療。免疫診斷一直是研究的熱點，但因多菌型(MB)麻風細胞免疫力缺陷，體液免疫力與正常人接近，而少菌型(PB)與MB相反，造成免疫檢測困難。另ML抗原大多與結(jié)核桿菌(Mtb)、非結(jié)核桿菌(NTM)有交叉反應，也限制了免疫診斷的發(fā)展。通過多年的研究，發(fā)展了許多方法并加以改進，特別是在ML基因組揭密后。

1 ML基因組詮釋前的免疫診斷研究

1.1 血清學實驗

1.1.1 酚糖脂(phenolic glycolipid I，PGL－I)為基礎的實驗 1981年Hunter和Brennan發(fā)現(xiàn)了ML特異抗原PGL－I，IgM類抗體對其末端三糖是特異性的，與Mtb，M.kansasii，M.avium，M.intracellulare感染沒有交叉反應，但由于ML體外不能培養(yǎng)，PGL－I的來源是個問題，加之PGL－I分子的脂質(zhì)無極性，使PGL－I包被到微量滴盤非常困難。為克服上述問題，1987年Fujiwara等成功地合成了這個末端三糖，從此麻風血清學實驗采用這種半合成的抗原。現(xiàn)在應用最廣泛的是天然的二糖與BSA連結(jié)(通過Octyl臂)的ND－O－BSA和天然三糖與BSA連結(jié)(通過phenyl臂)的NT－P－BSA抗原建立的ELISA，即:ND－O－BSAELISA和NT－P－BSA－ELISA。特別是ND－O－BSAELISA經(jīng)吳勤學等1進一步最適化研究，不但提高了敏感性，還節(jié)約了近10倍的抗原，并可用來預測麻風復發(fā)的可能性。Izumi等與Fujirebio協(xié)作開發(fā)了一種簡單的Serodia leprae(即顆粒凝集實驗)，可定性和定量檢測抗PGL－I抗體水平。我國吳勤學等亦建立了膠乳凝集實驗，2這兩種實驗不需昂貴設備，結(jié)果與ELISA平行，且可用濾紙法收集血標本。經(jīng)吳勤學等系統(tǒng)評價認為優(yōu)化后的ND－O－BSA－ELISA目前為最佳，1明顯提高了診斷的敏感性和特異性，但檢測少菌型病例仍達不到100%。1998年Bahrer－Sekula開發(fā)和評價了蘸棒實驗(dipstick test)，3小時內(nèi)即可檢出抗ML的IgM類抗體，與ELISA的符合率為97.2%，亦能檢測患者復發(fā)的可能性。該實驗后來又進一步改為ML flow test(ML明窗實驗)，能在10分鐘內(nèi)檢出抗體，可用于麻風分類和檢測接觸者患病的危險性，但其敏感性依然低于ND－O－BSA－ELISA。

1.1.2 蛋白抗原為基礎的血清學實驗 隨著基因工程的發(fā)展與應用，許多ML的蛋白可以克隆和表達，除35kD蛋白外，大都為熱休克蛋白(HSP)。HSP廣泛分布于真核與原核微生物中，且多與人的HSP有交叉反應(即有共同的序列)，許多交叉反應特異決定簇與Mtb有交叉反應。3尹躍平等4報道α2蛋白未發(fā)現(xiàn)與人的HSP有交叉反應。

1.1.3 35kD蛋白為基礎的血清學實驗 本抗原是用ML特異的單克隆抗體(Mab)鑒定出來的，后來Roche等5簡化為快速免疫層析卡實驗(rapid immuno－chromatographic card test)。此方法與直接ELISA(35kD)和PGL－I(ELISA和蘸棒實驗)比較時發(fā)現(xiàn)其快速且結(jié)果符合。但本法缺乏特異性，不能用于麻風早期診斷。

1.2 血清學免疫法應用的研究

1.2.1 用于麻風診斷 Roche和Bach等證明麻風抗體的產(chǎn)生與細菌指數(shù)(BI)相關(guān)。5，6吳勤學的結(jié)果亦表明血抗麻風桿菌IgM類抗體的水平與BI呈線性相關(guān)。7國外許多研究顯示，抗體在MB 75%～100%為陽性，在PB 15%～40%為陽性，在PN(純神經(jīng)炎類) 50%為陽性。8，9吳勤學報道抗體陽性MB＞95%，PB為80%。1研究還發(fā)現(xiàn)PB中抗體陽性者畸殘等級高。10，11血清學方法結(jié)合皮損數(shù)診斷可減少皮損少于6塊的MB的分類誤差，使分類誤診率減少9%，對血清學陽性的患者予以治療可減少不適當治療的產(chǎn)生，12但鑒于PB 60%和PN 50%的漏診率，尚不能用血清學方法作為單獨的診斷實驗。

在MB 95%Leprosy IDRI Diagnostic(LID)－1蛋白抗原的IgG類抗體陽性。檢測MB家庭接觸者的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病前1年，64%的IgG＋者反應增強，且早于PGL－I IgM，可用于早期檢測，在感染的犰狳中顯示若聯(lián)合LID－1和ND－O－BSA更適于早期診斷。13LID－1 IgG抗體在治療過程中比PGL－I IgM抗體下降快，可能是由于蛋白的清除比脂質(zhì)快。LID－1的IgG抗體在已被治療者中不存在或水平極低，未治療者很高，說明該抗原可以檢測治療效果或復發(fā)。王洪生等評價MMP II－ELISA和ND－O－BSA－ELISA顯示前者略優(yōu)于后者。ML2028(Ag85B)和ML2038(菌轉(zhuǎn)鐵蛋白)也可以檢測大多PB中的抗體。

1.2.2 在普通人群和家內(nèi)檢測接觸者 與正常普通人群相比，麻風接觸者患麻風的風險增加，但并不是所有研究都顯示接觸者的血清陽性率均高于正常普通人群。吳勤學等研究顯示麻風IgM類抗體水平呈“波紋現(xiàn)象”，即家內(nèi)接觸者＞近鄰＞普通人群。14總體人群監(jiān)測發(fā)現(xiàn)亞臨床感染率高于發(fā)病率，評價者在流行區(qū)檢測到陽性率為1.7%～31%。PB檢測IgM類抗體大部分為陰性，不能用于人群篩選，故血清學實驗尚不能用做單一的診斷實驗，但可用于:為治療目的區(qū)分MB和PB；15－17早期預測復發(fā)或發(fā)??；15，18在高危人群中(如接觸者)發(fā)現(xiàn)發(fā)病危險者，MB接觸者中PGL－I抗體陽性者發(fā)病危險比陰性危險高8倍以上；13，15，19，20在可行范圍內(nèi)隨訪治療。15

1.3 皮膚實驗

1.3.1 早期皮膚實驗抗原 對分枝桿菌的免疫反應，無論麻風還是結(jié)核，主要是細胞免疫反應。Mitsuda報道某些人類個體(含麻風患者)注射瘤型麻風患者組織懸液能產(chǎn)生局部結(jié)節(jié)反應。稱為麻風菌素實驗。1942年Dharmendra用氯仿和乙醚將多菌的麻風瘤提取去脂ML，皮內(nèi)注射此制劑24～48小時后僅產(chǎn)生“早期反應”。該抗原經(jīng)Sengupta進一步標化能引起早期和晚期反應。ML從犰狳獲得后，能從經(jīng)放射殺死的提純的ML超聲物中制取可溶性抗原，隨后離心除去細胞壁，標化濃度為1 mg蛋白/0.1 mL，即Rees抗原；或?qū)⒎派錃⑺赖腗L裂解，隨之用過濾法除去細胞壁并校正蛋白為0.5mg/mL，即Convit抗原，兩種抗原均能引起早期反應。麻風菌素實驗不能區(qū)別患者與健康者，且不同批麻風菌素皮膚反應的大小亦有所不同。

1.3.2 新皮試抗原 MLSA－LAM:用去污(垢)劑除去犰狳來源的ML的LAM和脂質(zhì)；MLCWA:用提取細胞壁法獲得的ML細胞壁抗原。兩種抗原正在尼泊爾作II期臨床實驗，以鑒別哪種抗原成分在起作用。

2 麻風桿菌基因組詮釋后的新診斷抗原的研究

ML在2000年完成基因組測序。其基因組在演化過程中逐漸退化，形成1116個無功能的偽基因，1614個蛋白編碼基因，從而喪失了許多重要代謝活性。RDL(Region of Divergence)區(qū)在BCG中失去，但在Mtb中仍然保留，所以兩者可區(qū)別。在失去的抗原中有兩個低分子量的蛋白，即培養(yǎng)濾液蛋白CFP－10 (culture filtrate protein 10)和早期分泌抗原靶蛋白(early secreted antigenic target，EAST－6)。

2.1 CFP－10 來源于Mtb，為免疫優(yōu)勢10 kD蛋白抗原，在Mtb感染的小鼠和人來源的T細胞能引起早期IFN－γ反應。從培養(yǎng)上清中IFN－γ的分泌可探知T細胞反應，有防止分枝桿菌感染的免疫能力(因為IFN－γ是Th1型細胞因子)。ML的CFP－10 (ML0050)基因位于Mtb基因組的RD1同序部分。研究表明在蛋白水平與Mtb的RD1中僅有40%同序，有可能發(fā)展成特異診斷麻風的一種T或B細胞反應抗原。用不交叉的部分重組的短肽有區(qū)別Mtb和ML的潛力?？筂L CFP－10(證明也是一種10 kD分泌蛋白)系用重組法獲得，其在BI陽性的麻風患者血清陽性率為83.3%，在BI陰性的麻風患者血清陽性率為18.4%，與受試的非TB、健康對照及其他皮膚病個體無交叉反應。統(tǒng)計學上，IgG抗體實驗與PGL－I具有可比性。

2.2 ML ESAT－6抗原 存在于Mtb中，為一種6 kD蛋白，在BCG中不存在。ML ESAT－6(ML0049)，在與上述相同的operon中發(fā)現(xiàn)，能被麻風患者T細胞識別，與Mtb有36%的交叉反應。重組不交叉的短肽P4和P9后，發(fā)現(xiàn)其雜交克隆單克隆抗體與Mtb無交叉反應。Parkash的研究顯示ESAT－6和CFP－10在早期檢測和監(jiān)測麻風治療中有作用。20總之，MLCFP－10和ESAT－6在結(jié)核流行率高的地區(qū)診斷ML具有局限性。

2.3 主要膜蛋白I(Majormembrane protein I)(MMP I) MMP I是一種粗制的35 kD蛋白，在TT患者引起強T細胞反應，重組的ML 35 kD在PB患者和接觸者中引起T細胞增多，且與Mtb無交叉反應。但與M.avium有交叉反應。研究表明有4種肽(P60－76，P132－151，P206－224，P269－286)可能為ML特異肽。

2.4 MMP－II 為一種分枝桿菌轉(zhuǎn)鐵蛋白，分子量為380中kD，在氨基酸水平與Mtb和M.avium的同序性為86%。用ELISA檢測抗體發(fā)現(xiàn)在PB和MB均顯示可作為一種診斷標志，但需擴大樣本以排除環(huán)境分枝桿菌的干擾。21

2.5 GroES 10 kD熱休克蛋白 系分子量為10～12 kD的蛋白，存在于ML和Mtb中，兩者間有90%的同序性，與E.coli的GroES hsp有44%同序性。ML的25－40序列肽與HLA－DRB5?0101有最強的親和性，可發(fā)展成為一種血或皮膚實驗，用于診斷TT。

2.6 45 kD蛋白 45 kD蛋白系一種富含氨基酸的抗原。盡管與Mtb有一定的同序性，但曾描述為一種ML的特異抗原，但在英國及巴基斯坦的研究中表明仍存在交叉反應。

總之，第一代抗原，含有豐富的ML抗原，但主要的問題是與Mtb、環(huán)境分枝桿菌有交叉反應，另MMP－II值得進一步研究與評價。

2.7 特異性引起T細胞反應的肽類的研究 原先已發(fā)現(xiàn)ML的70 kD、65 kD、35 kD、18 kD和10 kD抗原在TT病人可誘導T細胞反應。這些熱休克蛋白家族有高度的保守性，而且ML的70 kD、65 kD和10 kD抗原顯示與Mtb的同源性達90%，所以均不能用于麻風的診斷。鑒于此，Dockrell等22利用ML的基因組信息去鑒別ML特異的能在麻風患者中引起T細胞反應的肽類。特選產(chǎn)生有效T細胞反應的HLA－DR連接部分，用FINDPATTERNS程序進行篩選(與Mtb的序列差異性用FASTA程序)，發(fā)現(xiàn)8種肽在TT患者和健康的麻風接觸者中顯示特異性。Cole等23比較ML和Mtb的基因組，發(fā)現(xiàn)165個ML基因與Mtb基因無同序性，已發(fā)現(xiàn)其中29個有功能。以上述的知識為基礎，Geluk等24找到19個有潛力的診斷麻風的抗原(12個ML特異蛋白，5個與其它分枝桿菌有同源性)，選擇的依據(jù)是:分子量大?。皇欠翊嬖谟贖LA－II類連接部分；其在巴西麻風患者、家庭內(nèi)接觸者、TB及健康個體中IFN－γ產(chǎn)生與否。有5種抗原(ML0576，ML1989，M1990，M2283，M2567編碼的)顯示在細胞免疫和體液免疫檢測方面有一定意義，但這些抗原與Mtb及環(huán)境分枝桿菌的交叉反應尚未排除，是否真的對ML特異，還有必要進一步發(fā)掘除IFN－γ之外的細胞因子。25Spencer等26對4種重組蛋白和58種合成肽(從26個ML開放閱讀框架選出的，推測與人HLA－DR或HLA－I類分子連接)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肽P67，P68，P75，P91和P92有診斷潛力，但需擴大樣本加以確定。Aráoz等27用生物信息和比較基因?qū)W技術(shù)鑒定有診斷意義的蛋白抗原。當用細胞免疫法和ELISA法研究它們的意義時，僅發(fā)現(xiàn)2個蛋白(ML0308，ML2498)顯示了明顯的體液和細胞免疫原性，提供了特異診斷PB和MB的可能性。

3 小結(jié)與思考

綜上所述，麻風免疫診斷自發(fā)現(xiàn)麻風菌特異抗原PGL－I以來取得了相當大的進展，但以PGL－I為基礎的各種實驗在PB中陽性檢測率僅20%～40%(有報道達80%者)，因此需要進一步研究和鑒別新的敏感性更高的抗原，特別是包括能早期預測麻風反應的抗原。麻風基因組揭秘后，近200種重組的單體蛋白被發(fā)現(xiàn)能用于麻風的早期診斷。以往國內(nèi)外學者一致認為診斷麻風的實驗必須達2個100%(100%的敏感性和100%的特異性)。特提出如下思考:將現(xiàn)有經(jīng)過比較評價后的最有價值的方法進一步最適化處理，最大限度地提高其敏感性和特異性。鑒于有許多因素影響受試對象的MHC對混合抗原個體成分的反應。如:(1)基因(遺傳)組成(MHC多態(tài)性)，一種受試的肽是否能被MHC分子提呈；(2)個體的免疫狀態(tài)(如HIV＋或疾病引起無免疫反應能力)；(3)在感染期間(過程中)T細胞對特殊抗原反應波動(這對PB和MB來講是很重要的因素)。因此，設計一個高度敏感性和特異的麻風診斷實驗應將多種抗原或肽類拼成混合物或做為一種多聚蛋白，這可增加反應性。同樣可聯(lián)合多種肽而做成高敏感和特異的細胞免疫實驗早期和快速診斷麻風；將現(xiàn)有的方法按不同目的需要加以串聯(lián)、并聯(lián)、組合提高其特異性和敏感性亦是有價值途徑。

目前不但已重啟以PGL－1為基礎的實驗(如PGL－1－ELISA、ND－O－BSA－ELISA等)而且相關(guān)協(xié)作研究在WHO資助下已開展，如IDEAL(Initiative for Diagnostic and Epidemiological Assays for Leprosy)已于荷蘭首都阿姆斯特丹建立。目前正在用IFN－γ實驗組合重組蛋白(包括某些融合蛋白)選擇新的抗原，試圖改進血清診斷方法建立敏感和特異的麻風診斷實驗。

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本文主要針對IoT平臺中存在的數(shù)據(jù)安全性差和傳輸驗證效率低的問題展開了研究和分析，并提出使用區(qū)塊鏈技術(shù)來解決上述問題。體域網(wǎng)作為IoT的一部分，將其與區(qū)塊鏈技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)身份認證，是本文的研究重點。通過研究發(fā)現(xiàn)：數(shù)據(jù)能夠有效地實現(xiàn)防惡意用戶或者服務器的篡改，保證數(shù)據(jù)的分散性，符合現(xiàn)實生活對數(shù)據(jù)存儲的需求；數(shù)據(jù)間的傳輸、加密、驗證過程不再需要過于冗雜的計算，提高了數(shù)據(jù)操作過程中的計算效率，節(jié)約了計算開銷。與此同時，如何保護在公共信道中的公鑰不被他人用于共謀攻擊等問題，仍需要日后解決。此外，隨著IoT平臺的進一步發(fā)展，區(qū)塊鏈技術(shù)實際應用于智能醫(yī)療、智能家居等實際場景中將是未來發(fā)展方向。

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(收稿:2013－06－28)

Immunodiagnosis of leprosy

WU Qin-xue，WANG Hong-sheng.Institute of Dermatology，Chinese Academy ofMedical Sciencesand Peking Union Medical College，Nanjing，210042

This paper systematically reviewed immunodiagnosis of leprosy before and after genomic research.The tests before genomic researchmainly include phenolic glycolipid(Phenolic glycolipid I，PGL－I) and protein antigen serology experiment.The tests after genomic researchmainly include the application of culture filtrated protein 10 and EAST－6 in serology and peptides which cause specific T cell responses.

M.Leprae；immunodiagnosis

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所，南京，210042