沈博 陳晨 吳瑢 肖佳佳 王曉平

肝豆?fàn)詈俗冃缘姆肿舆z傳學(xué)研究進(jìn)展

沈博 陳晨 吳瑢 肖佳佳 王曉平

肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD）又名威爾遜?。╓ilson disease，WD），為7基因缺陷導(dǎo)致的一種常染色體隱性疾病，在國際上屬于罕見疾病，在中國是神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病中僅次于肌營養(yǎng)不良的第二常見疾病。其特征為膽汁銅排泄和肝內(nèi)銅藍(lán)蛋白合成障礙導(dǎo)致過量的銅在肝臟、腦、角膜等組織器官內(nèi)積蓄，導(dǎo)致肝病及錐體外系癥狀等肝外表現(xiàn)。早期診斷與排銅治療對(duì)改善WD患者預(yù)后意義重大，然而該疾病復(fù)雜的表現(xiàn)型使其診斷頗為困難，不同個(gè)體間的疾病轉(zhuǎn)歸也可迥異。近十年來，分子遺傳學(xué)方法與臨床疾病研究的結(jié)合愈發(fā)緊密，從分子水平準(zhǔn)確識(shí)別并預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展，進(jìn)而采取更為有效的個(gè)體化干預(yù)，是分子遺傳學(xué)研究向臨床轉(zhuǎn)化的核心。本文就WD的分子遺傳學(xué)研究現(xiàn)狀進(jìn)行簡要綜述。

肝豆?fàn)詈俗冃裕汇~藍(lán)蛋白；基因型；表現(xiàn)型；基因診斷。

肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD）又名威爾遜?。╓ilson disease，WD），是7基因缺陷導(dǎo)致的一種致命性常染色體隱性遺傳病，該疾病在全球范圍內(nèi)均有分布，好發(fā)于兒童及青少年，3～80歲均有報(bào)道。男性患病率略高于女性，這可能是雌激素水平以及鐵代謝差異的結(jié)果［1］。經(jīng)典的WD患病率約1/30000，攜帶頻率約0.011，基因頻率約0.56。最近一項(xiàng)英國的臨床研究對(duì) WD發(fā)病率重新進(jìn)行了評(píng)估，當(dāng)?shù)仉S機(jī)抽選的6000余人分別采取7基因全長和熱區(qū)8、14和18號(hào)外顯子直接測(cè)序，前者攜帶頻率為0.024～0.056，后者則僅為0.0044～0.0057，這意味著理論上WD的患病率不應(yīng)低于1/7000，確診病例數(shù)與理論發(fā)病率的差距可能來源于外顯率下降與診斷的局限性［2］。

WD的臨床表現(xiàn)高度多變，主要分為肝型和神經(jīng)型，肝型表現(xiàn)為急、慢性肝病，如爆發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）、肝硬化等，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要包括運(yùn)動(dòng)障礙和肌張力障礙的椎體外系癥狀，精神癥狀多伴隨神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為認(rèn)知、心境異常［3］，少數(shù)患者還可出現(xiàn)溶血性貧血和骨骼肌肉異常。

WD患者一經(jīng)確診，需要終身接受低銅飲食并排銅治療，絕大多數(shù)患者癥狀得到改善，生活質(zhì)量能夠明顯改善。

1 WD的基因

我國的突變熱區(qū)分布于2、5、8-13、16、18、19號(hào)外顯子，有研究者在對(duì)73位南方WD患者的7完整測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)32位患者存在R778L突變（34/146，23.29%），次常見突變類型為I1148T（14/146，9.59%）［4］；隨后另有研究者對(duì)我國北方WD患者的基因型研究中進(jìn)一步證實(shí)R778L突變與L770L連鎖緊密，是我國最常見的突變類型，其余常見的突變還包括A874V和P992L［5］。

2 ATP7B蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

銅作為人體內(nèi)重要的微量元素，處于穩(wěn)態(tài)時(shí)參與線粒體呼吸鏈、神經(jīng)遞質(zhì)合成以及鐵代謝等重要的細(xì)胞代謝過程，一旦過度蓄積則通過Haber-Weiss反應(yīng)加速活性氧生成，對(duì)細(xì)胞DNA、線粒體造成氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)肝細(xì)胞胞內(nèi)銅濃度正?；蚱蜁r(shí)，胞漿內(nèi)銅離子泵入TGN，與前銅藍(lán)蛋白結(jié)合形成一種6分子銅結(jié)合蛋白，即完全銅藍(lán)蛋白，后者將血漿中95%以上的銅轉(zhuǎn)運(yùn)至各器官。高銅環(huán)境下銅離子則以膜泡形式從肝細(xì)胞分泌至膽小管，通過膽汁排出體外，維持胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)。ATP7B功能結(jié)構(gòu)一旦受損即可出現(xiàn)銅藍(lán)蛋白下降和肝銅超載，進(jìn)而引發(fā)各類WD臨床表現(xiàn)。

3 WD基因型-表現(xiàn)型關(guān)聯(lián)

WD的表現(xiàn)型十分復(fù)雜，可概括為起病年齡范圍廣，臨床表現(xiàn)多樣以及代謝紊亂程度差異大。一方面，7多達(dá)500余種突變對(duì)ATP7B的結(jié)構(gòu)功能所造成的影響并不相同：結(jié)構(gòu)影響如ATP7B完整性喪失、錯(cuò)誤折疊、蛋白間作用受損，功能影響如磷酸化或銅轉(zhuǎn)運(yùn)異常，ATP結(jié)合力下降，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙等［8］。另一方面，可能還存在7之外的修飾基因，證據(jù)在于WD基因型相同的WD患者，甚至同卵雙生子之間也可能存在迥異的表現(xiàn)型［9］。此外，線粒體DNA突變以及環(huán)境作用也會(huì)對(duì)WD表現(xiàn)型造成重要影響。

E1064同樣位于N區(qū)SEHPL模體，該突變可導(dǎo)致ATP結(jié)合力完全喪失而出現(xiàn)癥狀嚴(yán)重的臨床表型，據(jù)報(bào)道1例16歲E1064K純合的男性WD患者表現(xiàn)出致死性FHF［15］。然而，盡管該突變與其下游的H1069位點(diǎn)非常臨近，卻并未改變N區(qū)的蛋白折疊，且E1064A突變體的熱穩(wěn)定性和胞內(nèi)定位與野生型相比并無明顯異常［16］。

R778L位于8號(hào)外顯子，等位基因頻率在14%～49%［11］。位于M2跨膜螺旋體的精氨酸殘基被亮氨酸替換，可能影響Cu+的跨膜運(yùn)輸。R778L與L770L高度連鎖，這種東亞特有的單倍型可能來自5500年前的共同祖先［17］。我國學(xué)者Liu等［18］的兩組研究報(bào)道均提示R778 L突變與肝型WD相關(guān)，值得注意的是，兩次研究中納入的患者起病年齡較輕，分別為16歲前起病占55/57，18歲前起病占72/75，這可能造成研究結(jié)論的偏倚。

M區(qū)的G943S和M769 V突變體表現(xiàn)為銅代謝異常，而其血漿銅藍(lán)蛋白水平多正常。撒丁島人群的常見突變?yōu)閱?dòng)子區(qū)-441/-427del，可能通過改變ATP7B的表達(dá)水平導(dǎo)致WD的發(fā)生。移碼突變、無義突變，插入缺失及剪切點(diǎn)突變等常造成編碼蛋白截?cái)啵瑢?dǎo)致起病時(shí)間更早，代謝異常更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為FHF等嚴(yán)重臨床表型也更多見［19］。

3.2 修飾基因 修飾基因是加重或緩解其他致病基因表型的一組基因。位于19q13.2的apoE是與WD相關(guān)性最強(qiáng)的修飾基因，該基因座主要存在ε2、ε3、ε4三種共顯性基因，ε3、ε3/3分別為最常見的等位基因和基因型，其編碼載脂蛋白E，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。ε4被認(rèn)為與脂質(zhì)紊亂、神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茲海默病的發(fā)生有關(guān)。有研究表明基因型為ε3/3的WD患者起病年齡較晚，可能是載脂蛋白E3具有抗氧化及神經(jīng)修復(fù)功能的保護(hù)效應(yīng)［20］。Litwin等［21］的研究成果顯示：ε4陽性的女性WD患者與野生型ε3/3相比平均起病時(shí)間早4年，且在H1069Q純合子的患者中更為明顯。該研究者推測(cè)，雌激素對(duì)神經(jīng)生長所具有的保護(hù)效應(yīng)只在ε3/3基因型中生效，而ε4陽性基因型剝奪了這一保護(hù)機(jī)制造成機(jī)體對(duì)毒性物質(zhì)耐受力下降。

朊病毒相關(guān)蛋白曾在體外研究中被證實(shí)具有銅離子結(jié)合能力，可能參與人體銅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。編碼該蛋白的PRP基因129密碼子存在多態(tài)性，此處的蛋氨酸（M）如被纈氨酸（V）替代可以導(dǎo)致WD起病時(shí)間提前約5年，但不改變癥狀表型［22］。

關(guān)于WD基因型-表型聯(lián)系的研究中大多數(shù)結(jié)論尚未有定論。一方面，確定起病年齡及臨床表型絕非易事，常因接診醫(yī)生的差異而具有明顯的主觀性；另一方面，因?yàn)閃D發(fā)病率偏低，更為罕見的基因型只能通過生物信息學(xué)技術(shù)或異種同源蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，難以在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與表現(xiàn)型建立關(guān)聯(lián)。此外，疾病表現(xiàn)型不能簡單還原為特定的基因型，而是亞細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)的、復(fù)合的外顯。建立基因型-表型關(guān)聯(lián)有賴于更實(shí)用的 WD臨床分型，更廣泛的科研臨床合作以及更深入的分子機(jī)制研究。

4 WD基因診斷的方法與評(píng)價(jià)

由歐洲肝臟病學(xué)會(huì)出臺(tái)的最新肝豆?fàn)詈俗冃灾委熤改现?，基因檢測(cè)陽性在診斷量表中被賦予了最高的權(quán)重［25］。WD的基因檢測(cè)方法可以分為直接測(cè)序和單體型分析兩大類。直接測(cè)序能夠明確突變的具體類型，是目前診斷WD的標(biāo)準(zhǔn)方法，由于WD基因外顯子區(qū)長達(dá)4.3 kb，通常僅針對(duì)突變熱點(diǎn)測(cè)序以期在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效經(jīng)濟(jì)。單體型分析是通過靶基因內(nèi)部或側(cè)翼的分子標(biāo)記實(shí)施檢測(cè)獲取遺傳信息，通常選用7側(cè)翼的微衛(wèi)星序列或其內(nèi)部SNP位點(diǎn)做標(biāo)記，單體型分析不需要明確突變類型，適用于對(duì)已經(jīng)確診WD患者的親屬進(jìn)行篩查，其缺點(diǎn)在于對(duì)低概率基因重組可能造成假陰性結(jié)果。此外，新一代測(cè)序技術(shù)能實(shí)現(xiàn)全外顯子乃至全基因組測(cè)序，未來WD的基因診斷必將更及時(shí)而全面。

WD傳統(tǒng)診斷依賴臨床癥狀和生化指標(biāo)，然而，同時(shí)出現(xiàn)血清銅藍(lán)蛋白水平降低、神經(jīng)系統(tǒng)與角膜K-F環(huán)三聯(lián)征的患者并不多見，大部分患者早期僅為不明原因的肝功能異?；蜚~藍(lán)蛋白水平下降，此時(shí)基因檢測(cè)結(jié)果往往起決定性作用［26］。未經(jīng)治療的WD致死率極高，對(duì)確診WD患者的親屬實(shí)行基因檢測(cè)可以避免對(duì)雜合子實(shí)施不必要治療。目前 WD的產(chǎn)前診斷尚未列入常規(guī)推薦。然而，鑒于7基因具有明顯的異質(zhì)性，啟動(dòng)子等非翻譯區(qū)突變也屢有報(bào)道，基因診斷的陰性結(jié)果并不能完全排除WD的可能。進(jìn)一步確立WD高頻突變類型和地域、人種及疾病表型的關(guān)系將非常有助于提高基因診斷的準(zhǔn)確性與實(shí)用性。

總之，WD在我國較為常見，是目前少數(shù)能得到有效治療的神經(jīng)遺傳病。早期診斷及排銅治療能顯著改善這類患者的預(yù)后，如何做到早期識(shí)別診斷、準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病程進(jìn)展并采取有效治療，是分子遺傳學(xué)研究向臨床轉(zhuǎn)化的切入點(diǎn)。目前對(duì)于WD基因型-表現(xiàn)型關(guān)聯(lián)的報(bào)道大都效力不足，進(jìn)一步開展分子遺傳學(xué)研究從分子層面闡明疾病機(jī)制，可能更將有助于臨床基因診斷，為干細(xì)胞移植、基因治療等新興治療方式提供助力。

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：1006-2963（2014）06-0437-04

2014-02-16）

（本文編輯：鄒晨雙）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.015

200080上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)科

王曉平，Email：x_p_wang@sjtu.edu.cn