王兆永，劉佰純，田曉豐，池 琦，魏麗娟，王春田，曹 宏＊

核糖核苷酸還原酶小亞基M2在腫瘤中表達(dá)及意義的研究進(jìn)展

王兆永1，劉佰純1，田曉豐2，池 琦1，魏麗娟1，王春田1，曹 宏2＊

（1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033）

核糖核苷酸還原酶（Ribonucleotide Reductase．RR）在DNA合成、修復(fù)及細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用，近來被認(rèn)為是癌癥治療的重要靶點(diǎn)。RR包含3個(gè)亞單位，分別是大亞基RRM1、小亞基RRM2和小亞基p53R2。RRM2亞基不僅和DNA的合成密切相關(guān)，對惡性腫瘤生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤耐藥的產(chǎn)生都具有影響．在絨癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌等多種人體癌組織中發(fā)現(xiàn)RRM2的表達(dá)水平有異常升高的情況，抑制RRM2的高表達(dá)，可以降低RR酶的活性，抑制癌細(xì)胞的生長，增加腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)耐藥。針對RRM2在腫瘤中高表達(dá)的抗腫瘤藥物主要有：3－AP、吉西他濱、RRM2的小干擾RNA、RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為腫瘤的治療提供一個(gè)新的策略。

1 RRM2的結(jié)構(gòu)和功能

腫瘤的形成和生長均與細(xì)胞的生長相關(guān)，而細(xì)胞的分裂、增殖及分化有賴于DNA的合成，核糖核苷酸還原酶（RR）存在于所有的生物細(xì)胞中，它是唯一催化核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸的酶，它能夠?qū)⒑颂呛塑账岬?＇－二磷酸催化轉(zhuǎn)化成2＇－脫氧核糖核苷酸，而脫氧核糖核苷酸是DNA合成和修復(fù)的原材料，因此RR是DNA合成和修復(fù)通路中的限速酶［1－3］。在核苷酸代謝過程中發(fā)揮核心作用，對細(xì)胞的分裂、增殖及分化具有重要作用。根據(jù)金屬輔助因子不同，RR可分為三類，而基于序列同源性和別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制，第I類又可進(jìn)一步分為la，lb，和Ic三個(gè)亞類，人、鼠和大腸桿菌等的RR屬于la亞類。RR全酶結(jié)構(gòu)包括大亞基α和小亞基β，形成α2β2的異四聚體結(jié)構(gòu)后方具備活性?，F(xiàn)已鑒定出人的RR全酶由一個(gè)大亞基Ml（RRM1）和一個(gè)小亞基（RRM2或P53R2）組成［4］。大亞基RRM1包括底物和變構(gòu)效應(yīng)物位點(diǎn)，且含有直接供給電子的琉基，控制著底物的特異性及酶活性的開／關(guān)，是腫瘤抑制基因，也是吉西他濱（Gemcitabine）的分子靶點(diǎn)。RRM2基因位于人染色體2p25→p24，全長10．3kb［1，5］，它是一個(gè)同源二聚體，由8個(gè)長螺旋結(jié)構(gòu)互相折疊形成，其內(nèi)包含兩個(gè)相同的二價(jià)鐵核心和一個(gè)酪氨酰自由基，這些對催化過程中觸發(fā)電子運(yùn)輸非常必要，通過酪氨酸殘基的苯環(huán)形成特異的自由基而參加催化反應(yīng)，其具有攜帶接觸抑制區(qū)，控制底物轉(zhuǎn)化的功能［6］。研究表明，RRM2除參與DNA合成外，對惡性腫瘤生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤耐藥的產(chǎn)生都具有影響［7］。日本研究人員于2000年首先克隆出RR的另一個(gè)小亞基P53R2，它的基因在結(jié)構(gòu)上和RRM2有80%以上的一致性［4，8，9］。當(dāng)DNA損傷后P53R2可取代RRM2，與RRM1形成RR全酶，為DNA合成提供dNTPs，并進(jìn)一步修復(fù)DNA［10］。

2 RRM2在腫瘤中的表達(dá)及意義

有研究應(yīng)用傳統(tǒng)的免疫組化方法，首次在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。℅TD）中檢測出了RRM2的表達(dá)部位和表達(dá)水平。近年來鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院崔金全教授用免疫組化、免疫印跡和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）方法，即從mRNA和蛋白水平證明RRM2在葡萄胎和絨癌細(xì)胞中存在高表達(dá)。Mark S等［11］使用小干擾RNA（small interfering RNA，即siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾，通過抑制胰腺癌細(xì)胞中RRM2表達(dá)，增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，同時(shí)構(gòu)建了胰腺癌的原位移植瘤模型，通過全身給藥抑制腫瘤的RRM2表達(dá)，結(jié)果表明RRM2的siRNA與吉西他濱的有協(xié)同作用，顯著抑制腫瘤的生長，增加腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。他們研究證實(shí)了腫瘤細(xì)胞中RRM2的表達(dá)對吉西他濱化療耐藥至關(guān)重要，并首次證明了以siRNA全身給藥為基礎(chǔ)的治療，可增強(qiáng)核苷類抗癌藥的療效；另有研究表明在胰腺癌（尤其是不能手術(shù)的胰腺癌）患者中，RRM2的表達(dá)也起著關(guān)鍵的預(yù)測作用［12］；最近藤田等［13］的研究表明，對手術(shù)切除的胰腺癌患者檢測RRM2mRNA的表達(dá)水平，如其表達(dá)水平較低，則可提示這類患者使用吉西他濱化療有效；Fisher［14］從一個(gè)前瞻性數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選擇95例在2000年1月至2008年10月之間接受了胰十二指腸切除術(shù)胰腺癌患者的腫瘤標(biāo)本，并對腫瘤樣本中RRM1，RRM2進(jìn)行免疫組化分析，最終得出結(jié)論：RRM1表達(dá)與總生存期（OS）無關(guān)，腫瘤中RRM2的高表達(dá)與胰腺癌切除后無復(fù)發(fā)生存率（RFS）和總生存期（OS）減少相關(guān)，這些生物標(biāo)志物可能有助于個(gè)性化的輔助治療。但是xie等［15］的研究似乎得出了與之相矛盾的結(jié)果，他們的研究小組對117例接受了腫瘤切除手術(shù)的胰腺癌患者的腫瘤標(biāo)本構(gòu)建腫瘤組織芯片，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法測定RRM2蛋白表達(dá)量，并分組進(jìn)行陰性、陽性對照，采用Kaplan－Meier法估計(jì)總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS），采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型研究RRM2表達(dá)價(jià)值，最終得出結(jié)論：在胰腺癌組織中的RRM2蛋白表達(dá)既不能判斷可切除胰腺癌患者預(yù)后，也不能預(yù)測這些患者輔助吉西他濱治療是否獲益。Morikawa等［16］對117例膀胱標(biāo)本的組織芯片進(jìn)行RRM2免疫染色。觀察14例非腫瘤性膀胱上皮，均未見RRM2染色陽性；4例低級別膀胱上皮癌（UC）也未見RRM2染色陽性；83例高級別膀胱上皮癌（UC）中，69例RRM2染色陽性，其中3例鱗狀細(xì)胞癌RRM2染色均呈陽性，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的13例膀胱上皮癌（UC）中，12例RRM2染色陽性。在進(jìn)行了根治性切除術(shù)膀胱癌患者患者中，RRM2過度表達(dá)與肌層浸潤顯著相關(guān)。對15例異型反應(yīng)的膀胱炎及25例原位膀胱癌的小的活體標(biāo)本進(jìn)行RRM2免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果在15例異性反應(yīng)膀胱炎標(biāo)本中1例RRM2染色陽性（6．7%），在25例原位膀胱癌標(biāo)本中24例RRM2染色陽性（96%）。他們的研究結(jié)果表明，RRM2蛋白頻繁的過度表達(dá)可能在膀胱癌中發(fā)揮作用，它將是一種新型的膀胱癌的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。Morikawa［17］研究小組同樣對胃癌進(jìn)行了研究，他們選取了114例胃癌標(biāo)本，應(yīng)用RRM2單克隆抗體和組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析來確定RRM2蛋白表達(dá)情況，并對RRM2的表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。再利用RRM2小干擾RNA轉(zhuǎn)染3個(gè)胃癌細(xì)胞系，MKN－1，MKN－7和SNU－719（分別為低分化，分化良好和Epstein－Barr病毒相關(guān)GC），用MTT法檢測其對細(xì)胞生長的影響。結(jié)果：檢測114例胃癌標(biāo)本中52例RRM2蛋白表達(dá)，而在正常胃小凹上皮RRM2不表達(dá)，RRM2的表達(dá)與肌層浸潤，血管侵犯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。應(yīng)用小分子干擾RNA抑制RRM2表達(dá)，結(jié)果表明在所有這3個(gè)的胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長均減少。Morikawa研究表明RRM2蛋白表達(dá)與胃癌惡性潛能有關(guān)，它在胃癌細(xì)胞的生長發(fā)揮了重要作用，RRM2可以作為一種新穎的診斷／預(yù)后的標(biāo)記物和治療胃癌的一個(gè)潛在的治療靶分子。為了進(jìn)一步研究RRM2和結(jié)直腸癌（大腸癌）的相關(guān)性，Liu等［18］將結(jié)腸癌的臨床研究結(jié)果同RRM2的表達(dá)聯(lián)系起來，他們收集了437例結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行回顧性的研究，其中217例來自美國希望之城？？國家醫(yī)學(xué)中心（COH），220例來自浙江大學(xué)。他們應(yīng)用免疫組化（IHC）來確定的RRM2蛋白表達(dá)水平，用實(shí)時(shí)定量PCR來驗(yàn)證。通過siRNA下調(diào)RRM2表達(dá)水平顯著并特異的抑制細(xì)胞的生長，也降低了HT－29和HCT－8細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明RRM2是預(yù)測大腸癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素，也是一個(gè)潛在的判斷結(jié)直腸癌的化療反應(yīng)好壞的預(yù)測指標(biāo)。另一個(gè)來自中國上海微創(chuàng)外科中心（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院）研究小組研究了RRM2亞基在大腸癌中的作用及其在紫外線引起的DNA損傷修復(fù)中的作用。結(jié)果表明，RRM2過度表達(dá)與浸潤深度，低分化型，轉(zhuǎn)移階段呈正相關(guān)。RRM2過度表達(dá)可能與大腸癌的進(jìn)展相關(guān)，通過siRNA使RRM2基因沉默，可以抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，RRM2在大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮重要作用，這是一個(gè)潛在的治療大腸癌的策略。研究人員得出一個(gè)結(jié)論，RRM2在大腸癌的發(fā)生和紫外線引起的DNA損傷修復(fù)中可能是一個(gè)促進(jìn)因素。他們的研究表明，RRM2基因沉默抑制大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，RRM2可能在大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，抑制其功能可能是一個(gè)潛在的治療大腸癌的策略。也有研究表明，RRM2在乳腺癌和乳腺癌前病變中也存在的高表達(dá)，乳頭漿液性溢液涂片RRM2免疫組化染色可作為乳腺腺癌的鑒別手段［19］。最新的研究也表明RRM2在小細(xì)胞肺癌、膽管癌、上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)均有不同程度的增多，因只少數(shù)報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 針對RRM2的抗腫瘤藥物研究現(xiàn)狀

RR抑制劑類是目前最有開發(fā)前景的抗腫瘤藥物之一［20］。抑制RR的機(jī)制主要有2點(diǎn)：①直接滅活RRM2亞單位的酪氨酞自由基。②通過離子絡(luò)合作用對RRM2亞單位的離子中心發(fā)生不可逆性抑制作用。3－氨基吡啶－2－甲醛硫代縮氨基脲（3－AP）是目前最有效的RR抑制劑，對多種人類及小鼠腫瘤均有顯著療效，并能增加順鉑、環(huán)磷酞胺等抗腫瘤藥物的活性，但對其毒理作用機(jī)制，尤其對生殖毒性和遺傳毒性研究，尚不夠全面系統(tǒng)。吉西他濱（Gemcitabine）是另一種核苷酸還原酶抑制劑，主要作用于腫瘤細(xì)胞的DNA合成期，即細(xì)胞周期的S期，在一定的條件下，可以阻止Gl期向S期的進(jìn)展。目前臨床主要用于治療局部進(jìn)展性或轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌和不能手術(shù)的晚期胰腺癌等。近年來siRNA抗癌治療已成為研究的熱點(diǎn)，關(guān)于RRM2的siRNA研究也越來越多。眾多的實(shí)驗(yàn)證明小分子干擾RNA（siRNA）可以增加胰腺腺癌對吉西他濱的敏感性，并減輕腫瘤細(xì)胞的侵襲性。據(jù)報(bào)道利用具有高效轉(zhuǎn)染反義核苷酸功能的最新脂質(zhì)體將寡核苷酸轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，明顯抑制了細(xì)胞生長，降低了RRM2蛋白、mRNA的表達(dá)。研究證實(shí)，RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA能顯著減少可誘導(dǎo)系統(tǒng)中RRM2蛋白的表達(dá)，降低酶活性，抑制癌細(xì)胞生長，逆轉(zhuǎn)耐藥［21］。就在今年八月美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)美國國家癌癥研究院（NCI）可以對Lorus公司先導(dǎo)化合反義藥物－GTI－2040與羅氏的希羅達(dá)（Xeloda），即卡培他濱（Capecitabine）進(jìn)行治療轉(zhuǎn)移性乳癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)。這是FDA所批準(zhǔn)由Lorus和NCI合作進(jìn)行的第二項(xiàng)臨床試驗(yàn)計(jì)劃。第一次的試驗(yàn)計(jì)劃是將GTI－2040與阿糖胞苷合用治療急性髓性白血病，目前在美國還有一個(gè)關(guān)于GTI－2040治療腎臟癌的Ⅱ期臨床正在進(jìn)行中。也有報(bào)道將RRM2抑制劑和siRNA技術(shù)結(jié)合起來對其進(jìn)行體內(nèi)和體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究［22］。腫瘤組織尤其是高危和晚期患者RRM2高表達(dá)，可能會影響藥物治療效果，增加治療失敗的可能性。對高危和復(fù)發(fā)患者選擇抑制RRM2基因蛋白表達(dá)和RRM2酶活性的藥物，將有助于提高患者的治療效果。

目前腫瘤主要治療手段仍然是手術(shù)、放療和化療，雖然綜合治療較以往提高了患者的生存率，但有些腫瘤發(fā)現(xiàn)即為晚期，失去手術(shù)機(jī)會，放療及化療存在著盲目性，此外化療的耐藥也是臨床醫(yī)生及患者必須面臨的重要問題。近年來，隨著基因組學(xué)及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤基因靶向治療作為一個(gè)新型的治療策略，它具有準(zhǔn)確錨釘腫瘤部位，在局部保持相對高濃度，對正常組織細(xì)胞作用較小的特點(diǎn)，已經(jīng)成為腫瘤治療的一個(gè)熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明在多種腫瘤細(xì)胞中RRM2的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，它可用來預(yù)測某些腫瘤化療的療效，也可作為某些腫瘤的新型的診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。利用RRM2的siRNA、反義寡核苷酸和反義cDNA能夠抑制某些腫瘤中RRM2的表達(dá)，能夠抑制這些腫瘤細(xì)胞的生長逆轉(zhuǎn)某些化療藥的腫瘤耐藥性。我們有理由相信，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為腫瘤的治療提供一個(gè)新的策略。

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王兆永（1979－），碩士研究生，臨床醫(yī)師，主要研究方向肝膽腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究。

2013－02－27）

本刊來稿中參考文獻(xiàn)編寫存在的主要問題

1007－4287（2014）02－0341－04

＊通訊作者

本刊來稿中參考文獻(xiàn)的編寫存在以下主要問題，望作者在投稿時(shí)注意：①文獻(xiàn)不新：除了個(gè)別涉及到方法學(xué)的歷史文獻(xiàn)外，一般應(yīng)選擇與論文密切相關(guān)的近3～5年的文獻(xiàn)，其中綜述文章更應(yīng)有近1～2年的新文獻(xiàn)。在本刊來稿中，許多作者在寫論文之前，并沒有系統(tǒng)地查閱最新文獻(xiàn)，論文選題可能近幾年報(bào)道并不少，但引用的文獻(xiàn)卻多為10年以上的文獻(xiàn)，近5年的文獻(xiàn)很少，使論文的先進(jìn)性受到很大影響。②所選參考文獻(xiàn)與本文關(guān)系不大：醫(yī)學(xué)論文引用的文獻(xiàn)應(yīng)該是與論文中的方法、結(jié)果和討論內(nèi)容密切相關(guān)，不可缺少的文獻(xiàn)，對于那些已是本學(xué)科常識性的內(nèi)容，不必再通過引用參考文獻(xiàn)來說明。有的來稿在討論中牽強(qiáng)地引用一些可有可無的文獻(xiàn)，有些甚至與本文沒有明顯的關(guān)系，使文章內(nèi)容不突出。③文獻(xiàn)編寫無規(guī)律：本刊參考文獻(xiàn)采用“順序編碼制”，即根據(jù)正文中引用參考文獻(xiàn)的先后順序，在文后用溫哥華格式編寫，并要求在內(nèi)文相應(yīng)的地方用上標(biāo)的形式標(biāo)出。在本刊來稿中，有一部分作者在文內(nèi)沒有標(biāo)出參考文獻(xiàn)的引用位置，或參考文獻(xiàn)的著錄格式不對、著錄項(xiàng)目不全。④引用非正式發(fā)表的或尚未發(fā)表的文獻(xiàn)：一般來說，“會議資料”、“內(nèi)部資料”及“待發(fā)表”等文獻(xiàn)均不能算為正式的參考文獻(xiàn)，均不宜引用。