曾艷玲，曾曉峰，譚曉風(fēng)，張黨權(quán)

(中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004)

油茶是目前我國大力推廣的優(yōu)良食用油料樹種之一，油茶主產(chǎn)品茶油中油酸含量是所有植物油中最高的[1-3]。長期食用茶油，能降低膽固醇，使人體血脂濃度降低，從而防止血管硬化和血壓升高，降低心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生幾率[4]。在不斷推廣油茶新品種，開發(fā)油茶新產(chǎn)業(yè)的同時，如何更好更快地提高茶油及其副產(chǎn)品的質(zhì)和量是油茶科研的重點(diǎn)。

油體蛋白是包被在油體外部的一層磷脂和蛋白質(zhì)鑲嵌而成的半單位膜[5]。目前Tzen等[6]利用油體建立了融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，利用油體的疏水性，通過離心可以將油體和水相分離，從而得到分離純化的目標(biāo)融合蛋白，由此誕生了植物生物反應(yīng)器——油體表達(dá)系統(tǒng)，并成功獲得有生物活性的GUS[7]、水蛭素[8]和木聚糖酶[9]。對于油料植物來說，一方面利用油體表達(dá)系統(tǒng)可以融合具有營養(yǎng)價值的外源蛋白，改善種子的營養(yǎng)成分，提高種子食用或作為飼料的品質(zhì)，另一方面，油體煉油的同時，油體蛋白可分離獲得大量的目的蛋白，增加農(nóng)產(chǎn)品的附加值。為了構(gòu)建油茶油體蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，本研究中選取原核表達(dá)載體pET-30a為初始載體，將油茶油體蛋白基因和待表達(dá)分離的目的蛋白基因逐步插入載體，旨在為后期在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)油茶油體蛋白的同時表達(dá)目的融合蛋白提供物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

油茶籽為國審品種‘華碩’[10]，采自湖南省長沙市望城縣東城鎮(zhèn)油茶基地，采樣后迅速存于-80℃超低溫冰箱備用。載體pET30a和大腸桿菌Escherichia coli菌株BL21(DE3)為本試驗(yàn)保存。

1.2 試 劑

RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，TransStartTM FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，核酸內(nèi)切限制酶及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及cDNA合成

根據(jù)Invitrogen公司RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法操作。

1.3.2 全長cDNA克隆

根據(jù)已獲得的油茶油體蛋白基因[11]和油茶金屬硫蛋白基因[12]全長cDNA序列設(shè)計(jì)引物，并根據(jù)軟件分析在引物首端添加合適的核酸內(nèi)切限制酶。各引物見表1。

表1 引物及酶切位點(diǎn)Table 1 Primers and restriction enzyme cutting sites

PCR反應(yīng)體系為5×Trans Start Fast Pfu Buffer(Mg2+plus) 10.0μL，2.5mmol/L dNTPs 5.0μL，Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1.0μL，正反向引物(10μmol/L)各1.0μL，Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1.0μL，模板1.0μL，無菌水補(bǔ)充體積至50μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，之后72℃再延伸8min。

1.3.3 大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將過夜培養(yǎng)的原始菌液按1∶50稀釋，培養(yǎng)至OD值為0.5(大約3h)為初始誘導(dǎo)濃度，加入IPTG終濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)時間為4～5h。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測外源蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)情況[13]。

1.3.4 電泳檢測

瓊脂糖凝膠電泳：取3μL待檢DNA或PCR產(chǎn)物，與適量溴酚藍(lán)-二甲苯青指示緩沖液充分混勻，點(diǎn)樣至1.2％的瓊脂糖EB染色的凝膠孔中，在TAE電泳緩沖液中110 V電壓下電泳30min左右，在自動凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相，根據(jù)同時電泳的100bp DNA Plus Ladder譜帶作為相對分子質(zhì)量參照物，粗略估計(jì)每條譜帶的相對分子質(zhì)量。

SDS-PAGE電泳：將等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液加入到蛋白樣品中，沸水浴處理5～10min，然后12 000r/min離心1min，吸取20～40 μL上樣。配制12％的分離膠和5％的濃縮膠。按照8 V/cm的電壓比例進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)完全進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至15 V/cm，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)跑出膠外。電泳完成后將凝膠取出，考馬斯亮蘭R-250染色，脫色4～5次，進(jìn)行凝膠成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建策略

理論上，構(gòu)建成功的原核油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，能表達(dá)有活性的融合蛋白，不需要繁瑣的蛋白純化過程，而是利用油體中油體蛋白、三酰甘油酯(TAG)和單層凝脂分子(PL)的天然比例混合后，在體外形成油體，通過油體在中性介質(zhì)中離心漂浮，則可以將融合蛋白與其它雜蛋白分離，然后利用蛋白酶將目的融合蛋白從油體上切離而獲得純化的目的蛋白。

本研究中選擇常用的原核表達(dá)載體pET-30a，采用“PCR+酶切連接”的方法將油茶油體蛋白基因Co_oleI插入載體，構(gòu)建油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)入門重組載體；同樣采用“PCR+酶切連接”的方法，將準(zhǔn)備通過油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得的活性短肽基因(本研究中擬采用油茶金屬硫蛋白基因)，插入到入門重組載體的Co_oleI基因下游，并且確保2個基因之間有完整可表達(dá)的凝血蛋白酶位點(diǎn)，完成油茶油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建(見圖1)。酶切位點(diǎn)選擇遵循以下原則：屬于載體多克隆位點(diǎn)，但是目的基因序列內(nèi)部無此酶切位點(diǎn)；油體蛋白基因插入在待分離目的基因上游，且兩者之間有可供酶切的凝血蛋白酶位點(diǎn)。

圖1 油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建流程(以金屬硫蛋白基因?yàn)槔?Fig.1 Construction of oleosin expression system (metallothionein gene as example)

2.2 油茶油體蛋白基因分離及原核表達(dá)

以油茶‘華碩’近成熟種仁cDNA為模板，采用特異引物，PCR擴(kuò)展獲得油茶油體蛋白基因Co_oleI，插入載體pET30a(+)多克隆位點(diǎn)，通過擴(kuò)增、電泳檢測(見圖2A)及上海博尚生物技術(shù)有限公司測序確定pET30a(+)/Co_oleI重組載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物大小約16.68kDa(見圖2B)，與預(yù)期一致，說明入門重組載體構(gòu)建成功。

2.3 油茶金屬硫蛋白基因分離及原核表達(dá)

以油茶‘華碩’近成熟種仁cDNA為模板，采用特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)展獲得油茶金屬硫蛋白基因Co_comtI，插入載體pET30a(+)多克隆位點(diǎn)，通過擴(kuò)增、電泳檢測(見圖3A)及上海博尚生物技術(shù)有限公司測序確定pET30a(+)/Co_comtI重組載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物大小約7.87kDa(見圖3B)，與預(yù)期一致，說明油茶金屬硫蛋白原核表達(dá)體系構(gòu)建成功。

圖2 油茶油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)入門重組載體構(gòu)建電泳Fig.2 Gel electrophoresis of the entry recombinant vector of oleosin expression system in C.oleifera

圖3 油茶金屬硫蛋白基因重組載體構(gòu)建電泳Fig.3 Gel electrophoresis of the recombinant vector of metallothionein gene in C.oleifera

2.4 油茶油體蛋白+金屬硫蛋白的融合表達(dá)載體檢測

根據(jù)本項(xiàng)目中擬定的油茶油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建策略，將油茶金屬硫蛋白基因酶切連接至入門重組載體中，經(jīng)擴(kuò)增、電泳檢測及上海博尚生物技術(shù)有限公司測序確定pET30a(+)/Co_oleI/Co_ComtI重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖4)。

3 結(jié) 論

圖4 油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)重組載體凝膠電泳檢測Fig.4 Gel electrophoresis of oleosin expression system recombinant vector

油體蛋白是油體所特有的一類蛋白，一般占種子總蛋白的2％～10％，對維持油體的穩(wěn)定極為重要[14]。由于油體蛋白在油料植物種子中高水平積累，當(dāng)外源基因以融合方式與油體蛋白一起表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物通常也能達(dá)到較高的水平，而且外源蛋白和油體蛋白形成的重組融合蛋白非常穩(wěn)定，可在種子中長期、穩(wěn)定貯藏[15-16]。因此，新型的植物生物反應(yīng)器(油體表達(dá)系統(tǒng))應(yīng)運(yùn)而生。

油體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白的原理與重組質(zhì)粒在原核生物體內(nèi)大量表達(dá)外源基因相似，關(guān)鍵步驟在于載體構(gòu)建。本研究中以大腸桿菌為寄主進(jìn)行初步試驗(yàn)，結(jié)果表明構(gòu)建油體表達(dá)系統(tǒng)需要采用兩步克隆法，先構(gòu)建油體蛋白基因原核表達(dá)載體，然后在油體蛋白基因下游插入外源蛋白基因，因?yàn)樵松餅槎囗樂醋咏Y(jié)構(gòu)，一個啟動子能夠同時調(diào)控多個結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，通過兩步克隆法構(gòu)建的油體表達(dá)系統(tǒng)能夠形成“外源蛋白+油體蛋白”的重組融合蛋白。本研究中成功構(gòu)建了油茶油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)的原核重組載體，但是能否正確表達(dá)有活性的外源蛋白還需進(jìn)一步的條件優(yōu)化試驗(yàn)。油茶油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)另一關(guān)鍵技術(shù)是在外源蛋白和油體蛋白之間引入一個可被蛋白酶酶解的短肽結(jié)構(gòu)。有研究表明[17]，油體蛋白的兩端插入短肽不會影響油體蛋白在油體上的定位。同時，利用油體中油體蛋白、甘油三酯和磷脂酸肌醇的天然比例混合后，能夠在體外形成油體，通過油體在中性介質(zhì)中離心漂浮，則可以將融合蛋白與其它雜蛋白分離，然后利用蛋白酶將目的融合蛋白從油體上切離而獲得純化的外源蛋白。

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