■楊建松王 露郭 宏馬 鑫李 昆 王德培,3

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津牧豐飼料有限公司，天津300380；3.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

自20世紀(jì)50年代開始，在動(dòng)物日糧中添加抗生素對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)[1]。然而抗生素應(yīng)用帶來(lái)的耐藥性，藥物殘留以及土壤污染等問(wèn)題迫使各國(guó)開始考慮禁抗的決定[2]。歐盟自2006年起全面禁止在畜禽飼料中添加抗生素[3]，我國(guó)在飼料中批準(zhǔn)使用的抗生素種類也在逐漸減少[4]。人們開始尋求其他的替代品和替代技術(shù)，以保證畜牧業(yè)生產(chǎn)的效率與效益不受影響[5]。同時(shí)飼料資源短缺的問(wèn)題長(zhǎng)期制約著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展[6]，因此發(fā)展高效飼料工業(yè)，生產(chǎn)生態(tài)健康型飼料是當(dāng)務(wù)之急。尤其仔豬的消化功能和胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)尚不健全，通過(guò)生物發(fā)酵飼料代替抗生素添加飼料可以有效防治細(xì)菌性疾病，降低腹瀉率，促進(jìn)仔豬消化吸收，提高飼料利用率，從而使仔豬健康的生長(zhǎng)。

微生物發(fā)酵能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，降低飼料的pH值，使得發(fā)酵飼料具有了酸香味，從而改善了飼料適口性，刺激了仔豬的采食量[7]。發(fā)酵可提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率及利用率[8]，Canibe N等[9]研究表明，飼喂發(fā)酵飼料的豬只飼料報(bào)酬比飼喂干料飼料提高1.94%。發(fā)酵料中大量的益生菌會(huì)在腸道內(nèi)定植，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道微生態(tài)區(qū)系來(lái)抑制腸道中的致病菌[10]。無(wú)抗微生物發(fā)酵飼料還能對(duì)解決抗生素的濫用、殘留和耐藥性問(wèn)題提供新的思路，為生產(chǎn)安全、無(wú)毒的無(wú)抗生素肉食品開辟一條經(jīng)濟(jì)的途徑[11]。

本文以實(shí)驗(yàn)室篩選出的乳酸菌和芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，采用固體混菌厭氧發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)接種量、外加水量、多菌株的接種比例等發(fā)酵工藝進(jìn)行分析和優(yōu)化。通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝的改進(jìn)，使各個(gè)菌種能夠發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，從而發(fā)酵生產(chǎn)能夠在較低成本下得到適口性好，營(yíng)養(yǎng)豐富，并且含有大量益生菌的生物活性飼料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

枯草芽孢桿菌B10-5(Bacillus subtilis B10-5)、枯草芽孢桿菌WL-BA-1(Bacillus subtilis WL-BA-1)、豆粕乳桿菌（Lactobacillus soybean meal）、發(fā)酵乳桿菌TLa-6（Lactobacillus fermentum TLa-6），均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l、蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l pH值7.2～7.4；固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20 g/l。

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/l、蛋白胨5 g/l、NaCl 5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，瓊脂18 g/l，pH值7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/l、酵母浸出粉5 g/l、NaCl 10 g/l，pH值7.2～7.5；固體培養(yǎng)基加15 g/l瓊脂粉。

奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉100 g/l、乳糖20 g/l，pH自然。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏10 g/l、酵母浸出粉 5 g/l、葡萄糖 5 g/l、CH3COONa 5 g/l、檸檬酸二胺2 g/l、吐溫80 1 g/l、K2HPO42 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、MnSO4·7H2O 0.05 g/l、CaCO320 g/l；固體培養(yǎng)基加瓊脂粉20 g/l。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/l、乳糖10 g/l、牛膽鹽5 g/l、NaCl 5 g/l、中性紅0.03 g/l、瓊脂18 g/l，pH值7.0。

1.3 飼料

試驗(yàn)所用飼料由天津牧豐飼料有限公司提供，經(jīng)檢測(cè)其還原糖含量為0.55%，酸溶蛋白含量為1.17%，乳酸、乳酸菌以及芽孢菌均檢測(cè)不出。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 芽孢桿菌種子液制備

從LB培養(yǎng)基斜面挑取1環(huán)菌，接入到裝有50 ml肉湯液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速220 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)14 h。

1.4.2 乳酸菌種子液制備

從奶粉培養(yǎng)基里吸取2 ml培養(yǎng)液，接入到裝有100 ml MRS液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，放置于溫度42℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 h。

1.4.3 飼料固態(tài)發(fā)酵

將枯草芽孢桿菌B10-5、枯草芽孢桿菌WL-BA-1、豆粕乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌TLa-6與一定量的水混合，然后與一定量的斷奶仔豬全價(jià)料混勻，將其裝入發(fā)酵瓶中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定發(fā)酵飼料中還原糖的含量。

1.5.2 粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定發(fā)酵飼料中的總氮量。

1.5.3 酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

稱取發(fā)酵飼料2.00 g，加入體積分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸溶液10 ml，混合均勻，靜置5 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4 000 r/min條件下離心10 min，取全部上清液，按凱氏定氮法測(cè)定上清液的可溶蛋白質(zhì)[12]。

1.5.4 乳酸含量的測(cè)定

稱取發(fā)酵飼料5.00 g置于裝有50 ml蒸餾水的250 ml三角瓶里，浸提1 h，離心取上清液，然后用SBA-40E型生物傳感分析儀測(cè)定其中乳酸的含量。

1.5.5 活菌數(shù)的測(cè)定

枯草芽孢桿菌用可溶性淀粉培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；乳酸菌用MRS培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)；大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

1.6.1 芽孢菌與乳酸菌比例的確定

選取芽孢菌與乳酸菌比例為1∶2；1∶1；2∶1；3∶1；4∶1這5個(gè)水平進(jìn)行分析。

1.6.2 總接種量的確定

選取接種量為4%、6%、8%、10%、12%、14%這6個(gè)水平進(jìn)行分析。

1.6.3 外加水量的確定

選取外加水量為43%、54%、67%、82%、100%、122%這6個(gè)水平進(jìn)行分析。

1.6.4 發(fā)酵溫度的確定

選取溫度為20、28、34、37、42 ℃這5個(gè)水平進(jìn)行分析，20、28℃發(fā)酵5 d，34、37℃和42℃發(fā)酵3 d。

1.7 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。選用L9（33）型三水平三因素正交表，以接種量、芽孢菌與乳酸菌比例、外加水量3個(gè)因素作為考察因素，分析對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬發(fā)酵飼料芽孢菌與乳酸菌混合比例的優(yōu)化(見表1）

表1 芽孢菌與乳酸菌混合比例對(duì)仔豬發(fā)酵飼料的影響

從表1可以看出，隨著芽孢菌與乳酸菌混合比例改變，還原糖含量先升高后降低，而乳酸含量沒(méi)有太大改變，當(dāng)混合比例為3∶1時(shí)還原糖含量最高，所以確定仔豬發(fā)酵飼料中芽孢菌數(shù)與乳酸菌數(shù)比例為3∶1。

2.2 仔豬發(fā)酵飼料接種量的優(yōu)化(見表2)

表2 接種量對(duì)仔豬發(fā)酵飼料的影響

從表2可以看出，隨著接種量的增加，還原糖隨之增加，不過(guò)接種量太高，在生產(chǎn)過(guò)程中所需要的菌液也會(huì)很高，這樣會(huì)增加生產(chǎn)成本，而8%的接種量還原糖和乳酸含量也處于較高水平，所以最終確定接種量為8%。

2.3 仔豬發(fā)酵飼料外加水量的優(yōu)化(見表3)

表3 外加水量對(duì)仔豬發(fā)酵飼料的影響

固態(tài)發(fā)酵的含水量是決定發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素之一。含水量高容易導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，從而減少基質(zhì)內(nèi)氣體；而含水量低會(huì)造成基質(zhì)膨脹程度低，菌體生長(zhǎng)受抑制。從表3可以看出，隨著外加水量的增加，還原糖含量先增大后減少，54%時(shí)處于最大值，所以確定外加水量為54%。

2.4 仔豬發(fā)酵飼料溫度的優(yōu)化(見表4)

表4 溫度對(duì)仔豬發(fā)酵飼料的影響

從表4不同發(fā)酵溫度所得的還原糖和乳酸產(chǎn)生的結(jié)果可以看出，20℃和28℃較低溫度下發(fā)酵5 d與較高溫度42℃發(fā)酵3 d可以達(dá)到同樣發(fā)酵效果。因?yàn)樵趯?shí)際規(guī)模生產(chǎn)中，嚴(yán)格控制固態(tài)發(fā)酵溫度難以實(shí)現(xiàn)，一方面嚴(yán)格控制溫度會(huì)增加成本，另一方面由于發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致物料堆積中心的溫度與邊緣的溫度差異必然較大，所以通過(guò)以上數(shù)據(jù)可以得出在20～42℃均可以，但在實(shí)際生產(chǎn)中控制溫度20～30℃作為發(fā)酵的溫度。

2.5 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

以單因素優(yōu)化的發(fā)酵條件，采用L9（33）型三水平三因素正交試驗(yàn)研究接種量、芽孢菌與乳酸菌的比例、外加水量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

以還原糖含量作為指標(biāo)進(jìn)行分析，如表6和表7所示。

表6 正交試驗(yàn)極差分析

由以上分析可以看出，影響因子的主次順序?yàn)椋航臃N量＞外加水量＞接種比例，即優(yōu)化后的條件是接種量為8%，接種比例為3∶1，外加水量為59%。正交試驗(yàn)中第5組即是這個(gè)組合，其還原糖含量可達(dá)到1.78%，乳酸含量為3.3%，酸溶蛋白質(zhì)含量為2.92%，芽孢菌數(shù)為5.6×105CFU/g，乳酸菌數(shù)為5.0×109CFU/g，并且有效的抑制了大腸桿菌，最終確定發(fā)酵條件。

表7 正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定仔豬飼料的發(fā)酵工藝：接種量為8%，芽孢菌與乳酸菌接種比例為3∶1，外加水量為59%，發(fā)酵溫度范圍為20～42℃。按此條件37℃下發(fā)酵72 h后還原糖含量增加了1.23%，是發(fā)酵前的3.24倍，酸溶蛋白質(zhì)含量增加了1.75%，是發(fā)酵前的2.50倍，乳酸含量增加了3.3%，同時(shí)產(chǎn)生了大量益生菌，而且有效的抑制了大腸桿菌。