劉 磊，王洪軍，辛 晴，周曉敏，趙亞君，黃 俠，趙 明

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，通遼028000）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染引起的心肌實(shí)質(zhì)或間質(zhì)的局限性或彌漫性病變［1］，病毒性心肌炎致使心肌收縮力功能下降引起心力衰竭是病毒性心肌炎患者死亡的重要原因［2］。心力衰竭是指心肌的舒縮功能障礙而導(dǎo)致泵血能力降低，是多種心血管疾病的終末共同通路，死亡率高，是臨床上需要解決的問題。以前人們對(duì)心力衰竭發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)停留在心臟疾患引起的心排血量降低，靜脈壓增高，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活及心室重構(gòu)上。近來研究發(fā)現(xiàn)在心臟衰竭心肌組織中存在心肌細(xì)胞凋亡，凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，從而引起心肌收縮力下降，細(xì)胞凋亡可能是心力衰竭發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，這是一種細(xì)胞自身基因控制的主動(dòng)性死亡過程。［3］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡干預(yù)是防治心力衰竭的一條的有效途徑［4］。凋亡的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress ERS）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條新的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的最重要標(biāo)志就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，這些蛋白主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein，GRP）78、GRP94、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白 （endoplasmic reticulum protein，ERp29）等，研究病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系，就要檢測(cè)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 GRP78、GRP94、ERp29表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。本研究通過觀察病毒性心肌炎心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞凋亡狀況并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94表達(dá)的關(guān)系，明確ERS是否介導(dǎo)了病毒性心肌炎心力衰竭小鼠心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生 BALB／c小鼠，二級(jí)動(dòng)物，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；CVB3（Nancy株）購自吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心病毒室，病毒原液效價(jià)為10-3TCID50／L；Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自 BioTeke，RNA simple Total RNA Kit購自TIANGEN，RNase固相清除劑購自天恩澤，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；In Situ Cell Death Detection Kit購自羅氏，DAB顯色液購自Solarbio，Triton X-100購自碧云天。

1.2 病毒性心肌炎BALB／c小鼠模型的制備

選清潔級(jí)BALB／c雄性小鼠40只。隨機(jī)分為病毒性心肌炎組和正常對(duì)照組（n＝20），病毒性心肌炎組小鼠每只腹腔注射內(nèi)含100 TCID50 CVB3的MEME agle’s液 0.2 ml。對(duì)照組小鼠每只腹腔注射生理鹽水0.2 ml。從注射病毒起每日觀察小鼠的一般狀態(tài)，主要觀察小鼠的反應(yīng)，詳細(xì)記錄小鼠飲食、毛色、活動(dòng)和排泄情況，。

1.3 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)

注射病毒第7天，將小鼠用3%戊巴比妥鈉15 mg／kg麻醉后仰臥位固定于恒溫操作臺(tái)上，于頸部正中取切口，然后鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，牽拉阻斷近心端，應(yīng)用30 G注射針頭在遠(yuǎn)心端穿刺動(dòng)脈，插入右頸總動(dòng)脈、升主動(dòng)脈，逆行插入左心室內(nèi)，通過1.4F微導(dǎo)管經(jīng)壓力換能器連接BL-420多道生理記錄儀測(cè)量各組小鼠左心室壓（left ventricular pressure，LVP）及左心室內(nèi)壓最大變速率（maximal change of ventricular pressure over time，dp／dt）變化，以反映心肌收縮力。

1.4 病理取材及TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

2組分別隨機(jī)取15只小鼠，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)后處死，，立即沿腹中線剪開，在無菌狀態(tài)下將小鼠左肋剪開，暴露心臟，用眼科剪子將心臟取出，取 1／3心臟組織（1）透化：滴加 0.1%Triton X100（0.1%檸檬酸鈉鹽配置）200μl，室溫放置 8 min；（2）PBS漂洗，5 min×3；（3）封閉：滴加 3%H2O2200μl，室溫放置 15 min；（4）滴加 TUNEL反應(yīng)液 50μl；（5）保濕、避光、37℃孵育 60 min；（6）滴加Converter-POD 50μl；（7）保濕、37℃孵育 30 min；（8）DAB顯色：加DAB底物50μl，待顏色剛剛變深時(shí)迅速置于水中終止反應(yīng)；（9）蘇木素復(fù)染：滴加蘇木素直至覆蓋玻片，浸入1%鹽酸乙醇中分化3 s，立即浸入自來水中，流水反藍(lán)20 min。將切片架置于75%、85%、95%的乙醇中，每個(gè)停留2 min。依次取出切片，擦干周圍液體，膠頭滴管滴加半滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，室溫晾干；（10）顯微鏡下觀察染色效果，×400鏡下拍照。

1.5 RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94的mRNA表達(dá)

（1）總RNA提?。豪每俁NA提取試劑盒（天根）提取樣本總RNA。（2）反轉(zhuǎn)錄：將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體用量如下：正常對(duì)照組樣本上樣量 2.8μl，病毒性心肌炎組樣本上樣量 3.4μl；正常對(duì)照組 ddH2O使用量 7.7μl，病毒性心肌炎組ddH2O使用量7.1μl。對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。（3）PCR檢測(cè)：首先將引物稀釋至 10μmol／L，引物信息：GRP78-F（5’-3’）CAGCCAACTGTAACAATCAAGRP78-R（5’-3’）CTGTCACTCGGAGAATACCAGRP94-F（5’-3’）TGAAGGCACAAGCATACCAGRP94-R（5’-3’）GACCGAAGTGTTGCCGTTTb-actinF（5’-3’）CTGTGCCC ATCTACGAGGGCTATb-actinR（5’-3’）TTTGATGTCACGCACGATTTCC，在PCR管中加入如下反應(yīng)體系：cDNA模板1μl，上下游引物各1μl，2×Taq PCR Master-mix 10μl用 ddH2O補(bǔ)足至20μl。擴(kuò)增條件為：94℃變性5 min后，進(jìn)行24～32個(gè)循環(huán)：94℃ 變性1 min，61.5℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)，置于4℃5 min。（4）電泳分析瓊脂糖凝膠的配制：PCR產(chǎn)物電泳用1.5%的凝膠，將混合的凝膠液置于微波爐中加熱至沸騰，使膠完全融化，放置室溫冷卻，將凝好的膠及制膠板放入電泳槽中，使電泳緩沖液剛剛浸過膠面，進(jìn)行點(diǎn)樣，然后接通電泳儀電泳，電泳過后利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)得到的凝膠進(jìn)行拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較用配對(duì) t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況及病理學(xué)改變

正常組小鼠活動(dòng)正常全部存活，病毒性心肌炎組小鼠在注射CVB3后出現(xiàn)豎毛、蜷縮、不喜進(jìn)食、活動(dòng)減少等體征，注射CVB3后3天起，病毒性心肌炎組小鼠開始出現(xiàn)死亡，至5～7 d病死率達(dá)到高峰。心臟大體改變：正常組小鼠心臟外觀無明顯改變。病毒性心肌炎組病變嚴(yán)重，外觀心肌呈淡黃色、質(zhì)地較軟、呈松弛擴(kuò)張狀態(tài)狀態(tài)，與正常對(duì)照組小鼠相比心臟擴(kuò)大，心臟表面有白斑或出血斑，心外膜下淤血。光鏡觀察：HE染色結(jié)果：對(duì)照組小鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，未見心肌纖維變性壞死等病理性改變。病毒性心肌炎模型組病理改變明顯，可見心肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)明顯水腫（圖1）。

Fig.1 Pathological changes（HE×200）

2.2 BALB／c小鼠病毒性心肌炎心臟血流動(dòng)力學(xué)改變

正常對(duì)照組小鼠與病毒性心肌炎模型小鼠心臟的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)情況見表1，可見反應(yīng)病毒性心肌炎模型組小鼠心肌收縮力指標(biāo)LVP和dp／dt與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性。（P＜0.05），而正常對(duì)照組小鼠與病毒性心肌炎模型小鼠心功能指標(biāo)組內(nèi)觀察結(jié)果無顯著差異。

Tab.1 Changes in cardiac hemodynamic parameters in mice（n＝15，）

Tab.1 Changes in cardiac hemodynamic parameters in mice（n＝15，）

LVP：Left ventricular pressure；dp／dt：Maximal change of ventricular pressure over time*P＜0.05 vs control

Group LVP（P／kPa） ＋dp／dt（kPa／s） -dp／dt（kPa／s ）Control 14.1±2.7 315±31 -262±29 VMC 9.1±1.9* 257±27* -198±28*

2.3 TUNEL法原位檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

用TUNEL法檢測(cè)病毒性心肌炎組小鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的胞核呈紅色顆粒狀，多分布在心內(nèi)膜、心外膜下及炎癥灶周圍（圖2）。凋亡對(duì)照組小鼠僅有少量凋亡的細(xì)胞（AI＝4.47±1.41），病毒性心肌炎組小鼠心肌細(xì)胞（AI＝35.31±7.15）較正常對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）。

Fig.2 Myocardial cell apoptosis

2.4 病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94的mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比較，病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01，圖 3，表 2、表 3）。

Fig.3 Endoplasmic reticulum chaperone GRP78 and GRP94 mRNA expression in myocardial cells of mice with viral myocarditis

Tab.2 Endoplasmic reticulum chaperone GRP78 mRNA expres-

Tab.3 Endoplasmic reticulum chaperone GRP94 mRNA expression in myocardial cells of mice with viral myocarditis

3 討論

大量證據(jù)表明，在多種心臟疾病中，心肌細(xì)胞凋亡可以引發(fā)心力衰竭。因此了解心肌細(xì)胞凋亡過程及凋亡信號(hào)途徑，并阻斷凋亡的信號(hào)途徑，可以增強(qiáng)細(xì)胞抵御凋亡能力，就能夠減少心肌細(xì)胞凋亡，從而延緩心力衰竭的進(jìn)程，在心臟疾病中減少心肌細(xì)胞凋亡可能是一種心力衰竭新的治療途徑。凋亡的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條新的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在心肌等肌細(xì)胞內(nèi)稱肌漿網(wǎng)，主要參與膜蛋白和分泌蛋白修飾和折疊［6］。沿肌原纖維排列，并通過T管與心肌細(xì)胞膜聯(lián)系。心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)主要由包繞肌絲的網(wǎng)狀縱形小管（longitudinal SR，L-SR）、參與形成三聯(lián)管的終末池（junctional SR，J-SR）和位于肌節(jié)Ⅰ帶的特化非終末池（specialized nonjunctional，SR）3部分組成［7］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)外界環(huán)境變化較敏感，各種應(yīng)激反應(yīng)引起的代謝異常、蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵形成障礙等原因均可引起蛋白錯(cuò)誤折疊以及未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過上調(diào)分子伴侶蛋白GRP78及GRP94表達(dá)、抑制蛋白質(zhì)合成、加速錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)降解等方式緩解ERS。然而持續(xù)或較嚴(yán)重的ERS則觸發(fā)凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)CHOP、caspase-12、JNK等促凋亡因子的表達(dá)及活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［9］。研究文獻(xiàn)報(bào)道：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能對(duì)于誘導(dǎo)病毒性心肌炎的心肌細(xì)胞凋亡有一定作用［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎組小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯降低；病毒性心肌炎心力衰竭小鼠心肌組織凋亡明顯增多；病毒性心肌炎組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78和GRP94的mRNA表達(dá)水平均明顯增高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示病毒性心肌炎心力衰竭小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能介導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡。這為我們研究病毒性心肌炎并發(fā)心力衰竭的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路，以及未來對(duì)于病毒性心肌炎并發(fā)心力衰竭的有效治療，具有積極的意義。

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