李曉麗，寧保安，劉 楠，馬新華，歐國榮，高志賢

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室，天津300050）

克倫特羅（clenbuterol，CL）是一種β2-腎上腺素受體激動劑，可用于治療呼吸系統(tǒng)疾病。當(dāng)其使用劑量達(dá)到治療劑量的5～10倍時，CL可增強肌肉發(fā)育，降低脂肪沉積。由于其特殊的生物學(xué)功能，常被非法用做飼料添加劑，導(dǎo)致其在畜產(chǎn)品中大量殘留。人類食用含有克倫特羅的肉制品后會出現(xiàn)頭暈、心悸、手指震顫等中毒癥狀。近幾年，由于食用殘留CL肉制品后引起的中毒事件屢屢發(fā)生。因此建立簡便、快速、靈敏的克倫特羅的檢測方法，對有效地預(yù)防食物中毒的發(fā)生是十分必要的。而免疫學(xué)檢測是目前最快速、靈敏、高效的檢測方法，為此，本文在對自制的 CL單克隆抗體［1］純化的基礎(chǔ)上，對其性質(zhì)進(jìn)行鑒定，旨在為今后對實際樣品的檢測及制備CL免疫檢測試紙條和試劑盒提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 克倫特羅單克隆抗體（本實驗室自制）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（Biotech，USA）；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）（Gibco，USA）；過硫酸銨（AP）、2，2’-二甲基聯(lián)苯胺（DAB）、沙丁氨醇、萊克多巴胺（Sigma，USA）；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（Amresco，USA）；維生素 A、硫酸慶大霉素、山羊抗小鼠 IgG（HRP標(biāo)記）、TMB（國產(chǎn)）

1.1.2 儀器 DYY-II型電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；MK3酶標(biāo)儀（Thermo，USA）；SH-3雙顯恒溫加熱磁力攪拌器（北京金北德工貿(mào)公司）；5ml免疫親和層析蛋白純化柱（天津華生生物有限公司）；半干轉(zhuǎn)移儀（大連競邁生物科技有限公司）

1.2 方法

常規(guī) ELISA法操作步驟［2］：（1）用包被液（pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）溶解包被抗原，37℃孵育2 h（或4℃過夜），PBST洗滌三次。（2）加含 3%OVA的PBS溶液封閉，37℃孵育 1 h，洗滌。（3）加 CL-BSA免疫小鼠血清（或雜交瘤細(xì)胞上清液、腹水）及陰性對照樣，37℃孵育1 h，洗滌。（4）加最適稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育0.5 h，洗滌。（5）加TMB底物使用液，室溫避光顯色15 min。（6）加終止液，50μl／well。用酶標(biāo)儀測 A450值。1.2.1 ELISA測定單克隆抗體活性［3］以 CL-BSA偶聯(lián)物作包被抗原，加系列稀釋的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液及小鼠腹水為一抗，骨髓瘤上清孔為陰性對照，常規(guī)ELISA方法操作。用酶標(biāo)儀測A450值。確定A450值大于陰性對照A450值的2.1倍的抗體反應(yīng)為陽性，其所對應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)即抗體效價，抗體效價高低說明抗體活性的高低。

1.2.2 ELISA測定單克隆抗體親和常數(shù)［4，5］用三種稀釋度（1∶50、1∶100、1∶200）的 CL-BSA作包被抗原，以系列稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗，按常規(guī)ELISA法操作。加終止液后450 nm處測A值。以單克隆抗體的不同濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的A450值為縱坐標(biāo)，繪制出3條測定曲線，以各線上部趨于平坦的 A450值為100%，查出 A450值為50%的濃度［Ab］t，這樣可以得到［Ab］t、［Ab′］t、［Ab″］t 3個值。按下列公式計算 K值：K1＝1／2（2［Ab′］t-［Ab］t）；K2＝1／2（2［Ab″］t-［Ab′］t）；K3＝3／2（2［Ab″］t-［Ab］t）。所得3個K值，取平均數(shù)即為親和常數(shù)。

1.2.3 抗體特異性的測定［6］（1）ELISA測定單克隆抗體與BSA的交叉反應(yīng)：用BSA作包被抗原，同時包被CL-BSA。加系列稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗，骨髓瘤細(xì)胞上清為陰性對照，按常規(guī)ELISA法操作。用酶標(biāo)儀測A450值。（2）與幾種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)：選擇與克倫特羅結(jié)構(gòu)和功能類似的四種藥物：萊克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸慶大霉素、維生素A。將各藥物均配制成系列濃度，采用間接競爭ELISA法進(jìn)行測定，各藥物系列濃度水平設(shè)2個復(fù)孔，取平均值。以各藥物濃度為橫坐標(biāo)，B／B0%為縱坐標(biāo)，作出各藥物的抑制曲線。由間接競爭ELISA方法測得A值及抑制曲線，找出IC50值范圍，并計算各自的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率（%）＝IC50藥物 ／IC50試驗藥物 ×100［7］。

1.2.4 腹水型單克隆抗體的純化 （1）鹽析（硫酸銨沉淀法）［8］：用常規(guī)硫酸銨沉淀法純化腹水中抗體，收集每步沉淀和上清進(jìn)行間接競爭ELISA試驗，驗證每步鹽析的上清和沉淀中的抗體活性，分析結(jié)果可得知每步鹽析所得成分中克倫特羅單克隆抗體活性。（2）免疫親和柱層析純化抗體［9］：將含有活性抗體的鹽析分離成分進(jìn)一步用免疫親和層析柱純化，以得到純度更高的抗體。將每步純化所得成分做SDS-PAGE實驗和ELISA實驗，以確定純化效果及抗體活性。

1.3 檢測克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［10，11］

將 CL標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋（0.01～100 ng／ml），以CL單克隆抗體為一抗，采用間接競爭ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以無CL抑制時的A450值為B0，相應(yīng)濃度CL抑制時的A450值為B，即以 B／B0為縱坐標(biāo)，以CL濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立曲線方程。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體活性測定結(jié)果

經(jīng)ELISA法測定，得知雜交瘤細(xì)胞上清液和小鼠腹水中CL單克隆抗體的效價為106，說明本實驗制備的CL單克隆抗體活性較高。

2.2 單克隆抗體親和常數(shù)測定結(jié)果

經(jīng)ELISA測定，1A2雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液上清與三個稀釋度的 CL-BSA包被原（1∶50，1∶100，1∶200）的反應(yīng)曲線如圖1，以各曲線上部趨于平坦段的A值為100%，查出其A值為50%時對應(yīng)的單克隆抗體濃度［Ab］t，根據(jù)親和常數(shù)計算公式得到單克隆抗體親和常數(shù)為：K＝2.90×1010mol／L（圖 1）。

2.3 抗體特異性

2.3.1 與BSA的交叉反應(yīng) 用ELISA法檢測單抗對BSA的交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示抗體對BSA反應(yīng)為陰性，隨抗體濃度增加A450值無變化；而對CL-BSA反應(yīng)為陽性，并且隨抗體濃度的增大A450值也呈梯度增大。表明本實驗制備的單克隆抗體與BSA無特異性結(jié)合反應(yīng)，只與CL發(fā)生特異性結(jié)合，從而證明單克隆抗體是完全針對CL小分子的（圖2）。

Fig.1 Antibody affinity analytic curve of the hybridoma cell culture fluid supernatant

Fig.2 Reaction of the monoclonal antibody to BSA and CL-BSA

2.3.2 抗體與幾種克倫特羅的結(jié)構(gòu)及功能類似物的交叉反應(yīng)（表1）

Tab.1 Cross-reaction rate of clenbuterol antibody with other analogs

2.4 腹水鹽析后抗體活性（效價）測定結(jié)果

腹水鹽析后抗體活性（效價）測定結(jié)果表明：50%的硫酸銨鹽析后所得沉淀中活性抗體效價最高，達(dá)106。因此可將50%的硫酸銨鹽析后所得沉淀進(jìn)行下一步的純化，以得到高純度的抗CL單克隆抗體（圖 3）。

2.5 免疫親和層析柱純化抗體結(jié)果

2.5.1 SDS-PAGE結(jié)果 純化后抗體只有一條帶，說明純化過程中去除了雜蛋白；與Marker比較，抗體分子量在83 kD左右（圖4）。

2.5.2 免疫親和柱層析純化抗體活性鑒 定四管洗脫液中均有抗CL的活性抗體存在，效價最高達(dá)105（圖 5）。

Fig.3 Antibody activity after ascites salt-out

Fig.4 Result of SDS-PAGE after antibody purification by immunoaffinity chromatography

Fig.5 Antibody activity after immunoaffinity chromatography

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，曲線方程 y＝1.265-0.658 x，R2＝0.9812，IC50＝14.554 ng／mL，計算后得到ELISA方法最低檢出限為 1.0 ng／ml（圖 6）。

Fig.6 ELISA standard detection curve to CL

3 討論

本實驗確定了自制的克倫特羅單克隆抗體的生物學(xué)特性，驗證了其具有較高的活性和親和力。對腹水型單克隆抗體進(jìn)行純化，純化后抗體的活性比之前有所降低，經(jīng)分析認(rèn)為：一是經(jīng)純化去除了與抗原非特異結(jié)合的抗體；二是在柱平衡過程中，會有一部分有效抗體未與柱結(jié)合而流失掉了；三是純化后抗體被稀釋，由于以上三方面的因素，使得抗體活性降低。通過實驗證明了此單抗針對BSA及克倫特羅的結(jié)構(gòu)和功能類似物幾乎無交叉反應(yīng)，因此具有較高的特異性。

用免疫分析技術(shù)（ELISA）檢測克倫特羅比用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）和高效液相色譜法（HPLC）檢測克倫特羅更加簡便，而且靈敏度更高，費用低廉。本研究通過間接競爭ELISA法確立了檢測克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為今后用免疫分析技術(shù)檢測樣品中克倫特羅及制備克倫特羅免疫檢測試紙條和試劑盒奠定了基礎(chǔ)并提供了依據(jù)。

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