饒桂波，邵洪澤，胡桂學＊，吳健敏

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧530001；2.吉林省獸醫(yī)科學研究所，吉林長春130062；3.吉林農業(yè)大學，吉林長春130118）

目前診斷鵝細小病毒（GPV）的主要方法有瓊脂擴散試驗、免疫熒光抗體試驗、黃牛精子抑制試驗、ELISA 和PCR 等［1－4］。近年來將變性高效液相色譜法（DHPLC）與PCR 方法結合用于微生物的檢測，使PCR 方法的敏感度提高了100倍，大大提高了樣品的檢出率［5－6］。為了解決鵝群中因GPV 排毒量低而難以檢出的問題，本研究擬建立一種敏感性更高的GPV PCR－DHPLC 檢測方法，用于鵝群中GPV 的檢測，為臨床GPV 感染的檢測，提供一種特異、敏感、快速、高通量的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 毒株

GPV JLDA 株，由吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院贈送；GPV JLTP株，由本實驗室分離保存。

1.2 試劑

Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder、T4DNA 連接試劑盒、pMD18－T 載體等，購自寶生物工程有限公司（大連）。

1.3 引物設計

根據GenBank中VP3 的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，序列如下：P1：5＇－ATA AGCGCC TTTCACAGC－3＇，P2：5＇－AACGCAGGATCAGACGAA－3＇，由寶生物工程有限公司（大連）合成。

1.4 PCR 體系建立

采用50μL 反應體系，在0.5 mL 反應管中依次加Buffer 5μL、2.5mmol／L dNTPs 2μL、滅菌二餾水35μL、2U／μL Taq酶1μL、20pmol／μL上游引物、下游引物各1μL、模板5μL?；靹蚝笊噪x心，通過梯度PCR 確定反應條件。

1.5 DHPLC條件選擇

根據變性高效液相色譜儀Aglient 1100 色譜柱：PS.DVB＆C18DNASep色譜柱（4.6mm ×50 mm，粒度3mm）。利用儀器軟件，根據目的基因序列的大小，堿基比率等預測柱溫。在柱溫確定后，摸索流動液體配比及流速，確定最佳條件。

1.6 PCR－DHPLC特異性分析

提取鵝副粘病毒、鴨瘟病毒及正常番鴨胚尿囊液的核酸進行PCR，按照1.4 的體系條件對PCR產物，進行PCR－DHPLC檢測，鑒定其特異性。

1.7 PCR－DHPLC敏感性分析

將GPV JLTP株病毒接種番鴨胚，提取尿囊液中的病毒核酸作為模板，利用上述引物擴增目的片段，擴增產物連接到pMD18－T 載體上克隆。提取質粒后測濃度，然后進行10倍系列稀釋，使每管含有106、105、104、103、102、101／μL 個拷貝數，并以此為模板進行PCR 擴增，檢測PCR 擴增產物。

1.8 PCR－DHPLC初步應用

對吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院保存的采自吉林省不同地區(qū)的100份病料，分別應用PCR 電泳法［7］和PCR－DHPLC方法進行檢測，對比并分析其檢測結果。

2 結果

2.1 GPV PCR 擴增退火溫度的優(yōu)化

按1.4PCR 的反應條件，選擇不同的退火溫度對GPV 陽性樣品進行PCR 擴增，將PCR 產物在紫外燈下觀察，結果在430bp處均出現預計的目的條帶（圖1），以退火溫度為63 ℃非特異擴增帶最少，故選擇63 ℃為PCR 擴增的退火溫度。

圖1 不同退火溫度下PCR 產物電泳結果Fig.1 The results of PCR products electrophoresis by different annealing temperatures

2.2 DHPLC法檢測結果

摸索好的條件為：色譜柱：PS.DVB＆ C18 DNASep色譜柱（4.6 mm ×50 mm，粒度3 mm）；柱溫：50 ℃；流動相：體積分數為50%緩沖溶液A，體積分數為50%緩沖溶液B；流速：1mL／min。上樣量：上述GPV PCR 產物5μL，檢測結果如圖2所示，出現預計目的峰值。

2.3 PCR－DHPLC 的特異性檢測

取GPV、鵝副粘病毒、鴨瘟病毒、正常番鴨胚液用同樣的方法制備核酸后，進行PCR－DHPLC 檢測。試驗結果如圖3所示。由圖3知，除GPV 出現特征性吸收峰外，而鵝副粘病毒、鴨瘟病毒、正常番鴨胚尿囊液在DHPLC分析圖譜中未出現與上述一致的特征峰圖，說明該方法具有較高的特異性。

圖2 DHPLC鑒定結果Fig.2 The result of DHPLC identification

2.4 PCR－DHPLC的敏感性檢測

試驗結果如圖4、5所示，使用建立的PCR－DHPLC方法檢測不同濃度的陽性標準品，檢測到的最低濃度為102／μL 個拷貝數。而PCR 方法檢測到的最低濃度為104／μL 個拷貝數。由此說明本研究建立的PCR－DHPLC方法敏感性比PCR電泳法高100倍。

2.5 PCR－DHPLC 臨床樣品檢測結果

對保存的100份臨床疑似樣品進行檢測，結果表明PCR－DHPLC檢測方法與常規(guī)PCR 方法陽性符合率100%。

3 討論

PCR－DHPLC檢測方法靈敏度高，耗時短，可以進行批量操作，并且不會出現假陽性結果。本研究建立的GPV PCR－DHPLC檢測方法，敏感性較高：最低能檢測到102／μL 拷貝數，比常規(guī)PCR 電泳檢測法高100倍、特異性強、僅對GPV 陽性樣品有目的波峰、重復性和準確性較好，在100 份樣品檢測中，陽性樣品檢測結果與常規(guī)PCR 電泳法一致。本研究中該方法在初步應用中沒顯示出明顯的敏感性優(yōu)勢，可能是以下原因：所檢測樣品容量較?。粯悠繁旧硎顷栃园l(fā)病的或陰性未感染的；采用的病毒核酸提取方法敏感性不夠等。

試驗中根據GenBank 上VP3 設計的引物［8］，在較大的溫度跨度范圍內，均能夠擴增出目的片段，表明本試驗設計的檢測引物序列在病毒基因組上是很保守的序列，適合用于GPV 的檢測。將GPV PCR 檢測方法與DHPLC 進行有機結合，能夠極大地提高GPV 檢測的靈敏度，同時也為臨床上檢測大批量樣品提供了可能。

相對其他的DNA 檢測技術來說，變性高效液相色譜技術具有下列優(yōu)點：靈敏度高，極少的核酸也能檢測到［9］；假陽性很少出現，結果的重復性較好；快捷方便，價格低廉，自動化程度高。一個樣品的檢測在10min內可以完成，花費不高，省去PCR 檢測方法中制膠、跑電泳等過程，這樣節(jié)省了大量的時間和花費。因此，利用變性高效液相色譜技術對突變株的篩選及核酸雙鏈的排查，很容易實現高通量和大規(guī)模的分析；回收的DNA 片段可以直接進行PCR、測序以及克隆到載體中［10］。另外，變性高效液相色譜技術也具有安全可靠的優(yōu)勢，避免一些放射性元素及有害的化學藥物對人體造成的傷害。

圖5 PCR－DHPLC 敏感性檢測結果Fig.5 The results of PCR－DHPLC sensitivity test 106、105、104、103、102（copies per milliliter）

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