陳美安，甄漢深，裴渭靜，趙 欣，沈永強(qiáng)，唐旭東＊

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137；2.深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518057；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；4.廣東高山動(dòng)物藥業(yè)有限公司，廣東信宜525300）

近年來(lái)，我國(guó)各禽畜支原體病頻繁發(fā)生，豬支原體導(dǎo)致的豬氣喘病的感染率、發(fā)病率居高不下，有的地方已達(dá)90%；雞毒支原體感染陽(yáng)性率為50%～80%，牛支原體病及羊支原體病感染率也明顯增加，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防與治療動(dòng)物支原體病主要采用抗生素類(lèi)藥物，雖然一些抗生素藥物對(duì)動(dòng)物支原體有較好的治療作用，但是所產(chǎn)生的耐用現(xiàn)象愈來(lái)愈嚴(yán)重，給臨床治療增加了困難。而我國(guó)中草藥具有藥源廣、價(jià)格低、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，近年來(lái)已得到人們的關(guān)注，其在畜禽支原體病臨床治療上具有很好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。因此本研究采用微量液體稀釋法［1－13］測(cè)定抗菌中藥對(duì)畜禽支原體的敏感性，并結(jié)合體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其抗支原體活性，為獸醫(yī)臨床用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株－PG45株、雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株－BG44T 株、羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株－Y－98株及非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero 293細(xì)胞）均由哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶研究員提供。

1.1.2 試 藥 兩面針、廣藿香、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮、艾葉等10味中藥飲片均購(gòu)自深圳萬(wàn)澤醫(yī)藥連鎖有限公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 KM2基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PPLO基礎(chǔ)培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、0.4%酚紅、磷酸鹽緩沖液（PBS）（均購(gòu)自Gibco 公司），3－（4，5－二甲基噻唑基）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO）（均購(gòu)自Sigma公司），0.25%胰酶（Typsin）（Hyclone 公司）。超凈工作臺(tái)（ZHJH－1112C，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（DHP－9032，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、酶標(biāo)儀（Plus 384型，美國(guó)）、倒置顯微鏡（CX41－32C02，OLYMPUS ）、離心機(jī)（湘儀TDZ5－WS，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（購(gòu)自蘭州科邁公司）等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 KM2培養(yǎng)基的配制：取KM2基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加適量馬血清、0.4%酚紅及青霉素等所需物，調(diào)整PH 值至7.6，0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PPLO 培養(yǎng)基的配制：PPLO 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加適量胎牛血清、0.4%酚紅及青霉素等所需物，調(diào)整PH 值至7.8，0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 0.5% MTT 的配制 稱(chēng)取0.5g MTT，溶于100mL 磷酸鹽緩沖液（PBS，PH 7.4）中，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，用鋁箔紙包住容器，置4 ℃避光保存即可?，F(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4 ℃避光保存2周內(nèi)有效。當(dāng)MTT 變?yōu)榛揖G色時(shí)不可再使用。

1.2.3 中藥70%乙醇提取物制備 取中藥飲片，粉碎，過(guò)10目篩，得中藥粗粉。稱(chēng)取中藥粗粉20g，加入10倍量70%乙醇，浸泡0.5h，回流提取3次，每次1.0h，合并3次提取液，定量過(guò)濾，濃縮并真空干燥得干浸膏。試驗(yàn)前用相應(yīng)培養(yǎng)基配成濃度為每1mL 提取液中相當(dāng)于含生藥量2g 的中藥原液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃冰箱保存，備用。（注：藥敏試驗(yàn)前需用50%枸櫞酸鈉調(diào)pH 至7.6～7.8）

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

1.2.4.1 支原體培養(yǎng)及顏色變化單位（CCU）測(cè)定

將凍干標(biāo)準(zhǔn)支原體株加到相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，牛支原體PG45株加到PPLO 培養(yǎng)基中，雞毒支原體BG44T 株及羊肺炎支原體Y－98 株均分別加到KM2培養(yǎng)基中，置37 ℃，5%CO2，相對(duì)濕度為80%～90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約7d，使其連續(xù)傳代，取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)菌液（牛支原體PG45 株為1×108CCU／mL、雞毒支原體BG44T 株為1×109CCU／mL、羊肺炎支原體Y－98 株為1×1010CCU／mL），用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋至1×104CCU／mL，作為工作菌液。

1.2.4.2 最小抑菌濃度（MIC）

（1）加培養(yǎng)基：取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于每排第1孔加入培養(yǎng)基150μL，第2～11孔加入培養(yǎng)基100μL，第12孔加入培養(yǎng)基200μL。

（2）加藥液：于第1孔加入藥液50μL，并用微量加樣器從第1孔開(kāi)始2倍倍比稀釋藥液至第10孔，混勻后于第10孔吸出100μL棄去。

（3）加工作菌液：第1～11孔加入工作菌液100μL，使得所有孔的液體總體積為200μL，藥物的終濃度從第1～10 孔依次為（單位：mg／mL）250.00、125.00、62.50、31.25、15.625、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49，共10個(gè)稀釋梯度，第11孔為陽(yáng)性對(duì)照孔（即生長(zhǎng)對(duì)照孔），第12孔為陰性對(duì)照孔。

（4）培養(yǎng)：滴入無(wú)菌液體石蠟密封，蓋上板蓋，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5%CO2，相對(duì)濕度為80%～90%孵育。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔發(fā)生顏色改變（即培養(yǎng)液中酚紅指示劑由紅色變?yōu)辄S色或橘黃色）且無(wú)混濁，加藥孔不再出現(xiàn)顏色變化時(shí)判定一次結(jié)果（發(fā)生顏色變化的前1 管的藥物稀釋濃度為最小抑菌濃度MIC）；5d后，所有孔不再發(fā)生顏色變化再判定一次結(jié)果。每味中藥平行重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.4.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥抗支原體的最小抑菌濃度（MIC）仍無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，故根據(jù)同類(lèi)試驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道［3－5］的判斷標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)進(jìn)行判定，即MIC≤7.81mg／mL 時(shí)較為敏感，MIC 為7.81～250 mg／mL 時(shí)為中度敏感，當(dāng)MIC＞250 mg／mL時(shí)為不敏感。

1.2.5 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.2.5.1 Vero293 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍干標(biāo)準(zhǔn)Vero 293細(xì)胞加到含10%胎牛血清、1×104IU 青霉素和1×104IU 鏈霉素的高糖DEME 培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5.2 Vero293細(xì)胞傳代及計(jì)數(shù) 將Vero 293細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液棄去，小心用適量PBS把貼壁細(xì)胞洗2～3次后，加少量0.25%胰酶，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中溫孵3～5 min；待細(xì)胞消化完畢后，加適量的培養(yǎng)基終止消化，并反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，制成均勻的細(xì)胞懸浮液；最后加適量培養(yǎng)基，并分裝于新的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，倒置顯微鏡下觀察，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5.3 體外細(xì)胞毒性測(cè)定 取健康Vero 293細(xì)胞培養(yǎng)液，接種于無(wú)菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200μL／孔，保證細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×104個(gè)／孔，5% CO2，37 ℃孵育，培養(yǎng)24h，至細(xì)胞完全貼壁。加入濃度梯度的藥液，每孔100μL，平行設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于5%CO2，37 ℃孵育24h，顯微鏡下觀察細(xì)胞情況。每孔加入0.5%MTT 溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。如果藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖洗2～3次后，再加入含MTT 的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，輕輕吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解后，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm 處測(cè)量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔即空白對(duì)照組（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），細(xì)胞對(duì)照組（不含藥物組）。根據(jù)半數(shù)抑制濃度（IC50）和最大安全濃度（TC0）來(lái)評(píng)價(jià)中藥對(duì)Vero 293細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

1.2.5.3 數(shù)據(jù)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)所測(cè)OD 值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。取6個(gè)平行復(fù)孔的平均值，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率＝（細(xì)胞對(duì)照組OD 值－加藥組OD 值）／（細(xì)胞對(duì)照組OD值－空白對(duì)照組OD 值）×100%。選取細(xì)胞抑制率小于5%的藥物濃度為該藥的最大安全濃度（TC0）。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

10味中藥中，7味中藥對(duì)3種畜禽支原體均具有不同程度的體外抑制和殺滅作用，均屬于中度敏感范疇，其中兩面針MIC值最小，其次甘草和黃柏。另外3味中藥廣藿香、土槿皮和艾葉MIC 值均大于250mg／mL，即對(duì)3種畜禽支原體幾乎不敏感。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10味中藥70%乙醇提取物體外抗畜禽支原體MIC值（n＝3）Table 1 MIC of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on livestock and poultry mycoplasma（n＝3）mg／mL

2.2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

由表2 及圖1 可知，加藥組和細(xì)胞對(duì)照組的OD 值，與空白對(duì)照組比較，P＜0.05，均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明加藥組和細(xì)胞對(duì)照組均有細(xì)胞存活。經(jīng)測(cè)定，兩面針、廣藿香、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏、甘草、白鮮皮、土槿皮和艾葉等10味中藥的TC0（單位：mg／mL）分別為3.91、15.625、7.81、3.91、7.81、7.81、7.81、7.81、＜0.49、3.91，IC50（單位：mg／mL）分別為43.62、93.27、84.99、47.20、79.34、81.94、104.55、83.79、3.12、49.68。當(dāng)兩面針、甘草、白鮮皮和艾葉濃度≤0.98mg／mL，廣藿香濃度≤3.91mg／mL，南板藍(lán)根、黃連、黃芩和黃柏濃度≤1.95mg／mL，土槿皮濃度＜0.49 mg／mL 時(shí)，其OD 值與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明10味中藥在上述各濃度范圍內(nèi)對(duì)Vero細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，且隨著藥物濃度的降低，OD 值增加，藥物對(duì)細(xì)胞抑制率降低；當(dāng)藥液高于自身TC0時(shí)，OD 值則顯著低于細(xì)胞對(duì)照組（P＜0.05），且隨著濃度增加，OD 值明顯下降，抑制率也相應(yīng)增加，表明在高濃度范圍內(nèi)中藥藥液對(duì)細(xì)胞具有不同程度的毒性作用，隨著濃度的增加毒性顯著增強(qiáng)。故可推斷中藥濃度與OD 值和抑制率之間存在顯著相關(guān)性。

表2 10味中藥70%乙醇提取物對(duì)Vero細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果（n＝6）Table 2 Cytotoxicity of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on vero cells（n＝6）

圖1 10味中藥70%乙醇提取物對(duì)Vero細(xì)胞抑制曲線Fig.1 Inhibition curves of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on vero cells

3 討論

支原體為兼性厭氧微生物，培養(yǎng)條件最好在37～38 ℃，5%～10%CO2和相對(duì)濕度為80%～90%的環(huán)境下培養(yǎng)。藥物對(duì)支原體的MIC測(cè)定結(jié)果與接種物濃度有很大關(guān)系，臨床上動(dòng)物體內(nèi)的支原體含量約為1×104CCU／mL，故本試驗(yàn)采用1×104CCU／mL作為支原體工作濃度，保持其他實(shí)驗(yàn)條件一致性，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性并具有較好的臨床意義。試驗(yàn)用支原體生長(zhǎng)的pH 范圍在7～8之間，以7.6～7.8最佳，為避免試藥本身pH 對(duì)支原體的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生影響而干擾試驗(yàn)結(jié)果，故測(cè)定前需先用5%枸櫞酸鈉將試藥pH 調(diào)至與培養(yǎng)基的pH 一致，即pH7.6～7.8。

畜禽支原體病主要以呼吸道感染為主，獸醫(yī)臨床用中藥治療主要以清熱解毒、清熱燥濕及祛風(fēng)殺蟲(chóng)為主。本試驗(yàn)主要選用具有清熱解毒、清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲(chóng)功效的10味中藥70%乙醇提取物對(duì)牛支原體PG45株、雞毒支原體Bc44T 株及羊肺炎支原體Y－98株的敏感性研究，結(jié)果表明兩面針、南板藍(lán)根、黃連、黃芩、黃柏和甘草這7味中藥均具有不同程度的體外抑制和殺滅作用。根據(jù)同類(lèi)試驗(yàn)文獻(xiàn)［5－7］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，7 味中藥對(duì)畜禽支原體均屬于中度敏感范疇。其中兩面針（3.91mg／mL≤MIC≤15.625mg／mL）、甘草（7.81mg／mL≤MIC≤31.25mg／mL）和黃柏（15.625mg／mL≤MIC≤62.50mg／mL）敏感性較好；其余3味中藥廣藿香、土槿皮和艾葉活性最低，MIC均大于250 mg／mL。同時(shí)，對(duì)空白試劑5%枸櫞酸鈉做了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)畜禽支原體生長(zhǎng)無(wú)影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些中藥溶液本身具有一定顏色，使得培養(yǎng)基顏色變深，用肉眼判斷其顏色變化，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)結(jié)果誤差。因此需要進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，以得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其實(shí)際操作工作有待進(jìn)一步完善。

根據(jù)單味中藥抗支原體活性初步篩選結(jié)果，本試驗(yàn)還結(jié)合細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以篩選出理論上可用于臨床的無(wú)毒或低毒的抗支原體中藥。本試驗(yàn)采用的是MTT 法測(cè)定中藥對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性，MTT 法是反映活細(xì)胞數(shù)量的方法，其原理是MTT 被代謝旺盛的活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原成的藍(lán)色甲簪結(jié)晶就越少，甲簪被溶解后所測(cè)得的光密度值就越小，說(shuō)明細(xì)胞存活率低。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明土槿皮對(duì)Vero細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性，文獻(xiàn)記載［16－17］其多作為外用藥使用，故因慎用或遵醫(yī)囑用藥；其他中藥細(xì)胞毒性很小，對(duì)篩選出具有較好抗支原體活性中藥具有重要的意義。中藥化學(xué)成分多而復(fù)雜，中藥在體內(nèi)的作用比體外要復(fù)雜很多，藥物進(jìn)入機(jī)體后對(duì)細(xì)胞的毒性濃度是否與體外細(xì)胞毒性濃度一致，有些中藥體外活性可能與臨床療效不一致，尚不清楚。因此仍需進(jìn)行藥理及臨床試驗(yàn)等深入研究工作。本細(xì)胞毒性試驗(yàn)，可確定藥物對(duì)細(xì)胞的最大安全濃度，評(píng)價(jià)藥物毒性，為以后臨床用藥提供一定參考。

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