荀文娟，侯冠彧，周漢林，施力光，曹 婷

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737）

Kiss－1基因于1996年被發(fā)現(xiàn)，并被鑒定為轉移抑制基因，在具有不同轉移能力的黑色素瘤細胞中表達存在差異［1］。隨后該基因編碼的產(chǎn)物kisspeptin被發(fā)現(xiàn)，G 蛋白偶聯(lián)受體54（G protein－coupled receptor 54，GPR54）是kisspeptin 的受體。在人、牛、羊、鼠等哺乳動物研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1 基因與GPR54基因一起組成Kiss－1／GPR54系統(tǒng)，參與動物下丘腦－垂體－性腺軸功能的調(diào)節(jié)［2］。Lents等［3］研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射Kisspeptin后備母豬初情日齡提前。Tomikawa等［4］也在初情期母豬下丘腦中檢測到Kiss－1基因高水平表達，表明下丘腦Kiss1／GPR54可能是母豬初情啟動的關鍵調(diào)節(jié)基因。鑒于Kiss－1基因在初情期啟動調(diào)控中的重要性，本研究推測Kiss－1基因可能與五指山豬高繁殖力和性早熟有關。一直以來，中國地方品種豬的高繁殖能力始終是中外學者的研究熱點。五指山豬產(chǎn)于海南省，是我國體型最小、體重最輕的珍稀品種，具有繁殖率高、性成熟早等特性［5］。

本試驗以五指山豬作為研究對象，檢測Kiss－1／GPR54系統(tǒng)在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達，從而為闡明動物生殖機理和早熟品種選種選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取日齡相近、健康、無生殖缺陷五指山母豬16頭，分別于30、60、90（初情期）和120日齡屠宰，采集血清和下丘腦組織樣品，血清樣品于－20 ℃冰箱保存，組織樣品液氮速凍，－70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus 總RNA 提取試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（SYBR R Premix Ex TaqTM）購自Takara；熒光定量PCR 儀購自eppendorf。

1.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈合成

采用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒提取總RNA。用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的品質，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度。采用SYBR?PrimeScriptTM RT－PCR reagent Kit中的反轉錄反應試劑進行cDNA 第一條鏈的合成。

1.4 引物設計

從NCBI下載已登錄的豬持家基因序列β－actin（DQ178122）、豬Kiss－1（AB466320）和GPR54（DQ459345）的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計合成兩對特異性引物，分析Kiss－1和GPR54在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達水平。引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences of quantitative real－time PCR

1.5 Real－time PCR

根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒建議的反應體系及優(yōu)化確定的反應條件，將設計并合成好的目的基因和看家基因的引物，分別加入反應體系：SYBR Premix Ex Taq II：12.5μL，PCR Forward Primer：1μL，PCR Reverse Primer：1μL，cDNA 溶液2μL，ddH2O：8.5μL，擴增條件：95 ℃預熱30s，PCR 循環(huán)參數(shù)為：變性95.0 ℃5s；退火60.5 ℃／58.5 ℃20s；延伸72 ℃10s，循環(huán)40 次。

1.6 血清FSH、LH、E2、P4 的測定

血清FSH、LH、E2、P4用化學發(fā)光法測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

目的基因的相對表達量采用－ΔΔCT 方法獲得，ΔCT 就是Kiss－1 和GPR54 相對內(nèi)參β－actin的表達量，ΔΔCT 為每個試驗組的ΔCT 與對照組的相對數(shù)值，目的基因的相對表達水平用2－ΔΔCT 表示。所有數(shù)據(jù)用Excel進行計算，結果用均值±標準差（Means±SD）表示，用SPSS 13.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗，以P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 Kiss－1mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達

由圖1可知，初情期前Kiss－1mRNA 表達量隨著五指山豬年齡的增長表達量逐漸升高，初情期（90日齡）時表達量達到最高（P＜0.05），到120日齡（初情期后）時表達量逐漸降低（P＜0.05）。

圖1 Kiss－1mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達Fig.1 Expression of Kiss－1mRNA in hypothalamus in different age of Wuzhishan pig

2.2 GPR54 mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達

由圖2 可知，GPR54 mRNA 表達量隨著五指山豬年齡的增長有升高的趨勢，但是差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 GPR54mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達Fig.2 Expression of GPR54mRNA in hypothalamus in different age of Wuzhishan pig

2.3 五指山豬30～120dFSH、LH、E2、P4 濃度變化

由表2 可知，五指山豬血清FSH、LH、E2、P4濃度變化的趨勢大體一致。初情期前，各激素水平逐漸升高，差異不顯著（P＞0.05），至初情期（90日齡）時顯著升高；血清FSH、LH、E2濃度在90日齡和120日齡時差異不顯著（P＞0.05），P4濃度在90日齡時顯著高于120日齡（P＜0.05）。

表2 五指山豬30－120日齡之間FSH、LH、E2、P4 濃度變化Table 2 Concentration changes of FSH，LH，E2，and P4of Wuzhishan pig from 30－day－old to 120－day－old

3 討論

Yasuko等［6］近年來研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1 基因參與調(diào)控下丘腦－垂體－性腺軸系生殖功能。在青春期，下丘腦中的Kiss－1 mRNA 表達增加，其編碼產(chǎn)物Kisspeptin與其受體GPR54結合，通過GnRH 刺激LH 和FSH 的釋放［7］。劉小輝等［8］用達那唑皮下注射，以誘導大鼠真性性早熟，表明處于青春期的大鼠下丘腦Kiss－1mRNA 表達量顯著高于青春前期。葛偉等［9］在雌性大鼠上也得出了相似結論?？梢?，Kiss－1mRNA 的表達與生長發(fā)育的時期密切相關，提示Kiss－1可能與性早熟的發(fā)生有關。本研究中，在初情期前，Kiss－1表達量隨著五指山豬年齡的增長呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，初情期（90日齡）時表達量達到最高（P＜0.05），隨后表達量顯著降低（P＜0.05），表明Kiss－1對五指山母豬初情期的啟動起重要的作用。劉萍［10］對Kiss－1 mRNA 在小梅山豬和蘇姜豬下丘腦的表達情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)小梅山豬和蘇姜豬從初生到初情期表達量逐漸上升，初情期后呈下降趨勢，與本試驗結果基本一致。而Shahab等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1和GPR54mRNA 在雌性猴子下丘腦的表達量隨著青春期發(fā)育過程逐漸升高，但在去勢雄性猴子中則只觀察到Kiss－1 mRNA 表達量增加，GPR54mRNA 表達量并未受影響。本研究中，下丘腦GPR54基因的變化不顯著，這一結果與去勢雄性猴和其他學者關于豬的研究結果相一致［11－12］。GPR54基因變化與其他物種不同可能與其配體對受體上調(diào)幅度有關［13］。可見，Kiss－1／GPR54在不同物種及性別個體青春期發(fā)育過程中的作用途徑還有待深入研究。

自研究者發(fā)現(xiàn)Kiss－1／GPR54 系統(tǒng)在生殖功能調(diào)控中的重要作用以來，Kisspeptin及其受體對生殖的調(diào)控迅速成為研究的熱點。性激素對下丘腦Kiss－1表達具有反饋抑制作用。Gottsch等［14］研究發(fā)現(xiàn)，給成年鼠注射極少量的Kisspeptin就可以引起其血清中LH 顯著增加。而對于幼年小鼠，只有高劑量的Kisspeptin 才能引起LH 含量變化。Brailoiu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin神經(jīng)纖維投射到弓狀核、視前區(qū)、視交叉后區(qū)等，這些區(qū)域是調(diào)控動物生殖GnRH 分泌的主要神經(jīng)核團所在區(qū)域，由此提示Kisspeptin參與GnRH 分泌的激素調(diào)控。劉萍［10］研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1mRNA 在各日齡小梅山豬的表達豐度與血漿LH、FSH、E2和P4水平相似并呈顯著相關。本試驗也得出了類似的結果，五指山豬血清FSH、LH、E2、P4水平在初情期前逐漸升高，至初情期時顯著升高，且達到一個峰值，與Kiss－1mRNA 表達豐度基本一致。說明Kiss－1mRNA 水平與初情期前后性激素分泌水平具有相似周期變化規(guī)律，證實Kiss－1基因對五指山母豬初情期的啟動具有重要的調(diào)控作用。

［1］Lee J H，Miele M E，Hicks D J，et al.Kiss－1，a novel human malignant melanoma metastasis－suppressor gene［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88（23）：1 731－1 737.

［2］Navarro V M，CastellanoJ M，F(xiàn)ernandez－Fernandez R，et al.Developmental and hormonally regulated messenger ribonucleic acid expression ofKiss－1and its putative receptor，GPR54，in rat hypothalamus and potent luteinizing hormone－releasing activity ofKiss－1peptide［J］.Endocrinology，2004，145（10）：4 565－4 574.

［3］Lents C，Heidorn N，Barb C，et al.Central and peripheral administration of kisspeptin activates gonadotropin but not somatotropin secretion in prepubertal gilts［J］.Biol Reprod，2008，135（6）：879－887.

［4］Tomikawa J，Homma T，Tajima S，et al.Molecular characterization and estrogen regulation of hypothalamic KISS1gene in the pig［J］.Biol Reprod，2009，82（2）：313－319.

［5］王 峰，姜維思，鄭心力，等.五指山豬資源保護現(xiàn)狀與建議［J］.海南農(nóng)業(yè)科學，2006（2）：89.

［6］Yasuko T，Satoshi K，Yoshihiro T，et al.Expression ofKiss－1，a metastasis suppressor gene，in trophoblast giant cells of the rat placenta［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1678（2－3）：102－110.

［7］Navarro V M，F(xiàn)ernandez－Femandez R，Castellano J M，et al.Advanced vaginal opening and precocious activation of the reproductive axis byKiss－1peptide，the endogenous ligand of GPR54［J］.J Physiol，2004，561（2）：379－386.

［8］劉小輝，劉 方，夏 治，等.Kiss－1在雌性性早熟大鼠下丘腦中mRNA 的表達［J］.中國當代兒科雜志，2007，9（1）：59－62.

［9］葛 偉，王海蓮，薛 江，等.Kiss－1 和GPR54 基因在雌性性早熟大鼠下丘腦中的表達［J］.山東大學學報：醫(yī)學版，2012，50（4）：71－75.

［10］劉 萍.Kiss－1基因在母豬初情期下丘腦－垂體－卵巢軸中的定位和發(fā)育性變化［D］.江蘇揚州：揚州大學，2008.

［11］Shahab M，Mastronardi C，Seminara S B，et al.Increased hypothalamic GPR54signaling：apotential mechanism for initiation of puberty in primates［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（6）：2 129－2 134.

［12］Li S，Ren J，Yang G，et al.Characterization of the porcine Kisspeptins receptor gene and evaluation as candidate for timing of puberty in sows［J］.J Anim Breed Genet，2008，125（4）：219－227.

［13］朱碧泉，李卓昭，吳 德，等.梅山與長大母豬下丘腦－垂體－卵巢軸Kiss1和GPR54基因的表達差異［J］.中國畜牧雜志，2011，47（13）：21－25.

［14］Gottsch M L，Cunningham M J，Smith J T，et al.A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse［J］.Endocrinology，2004，145（9）：4 073－4 077.

［15］Brailoiu G C，Dun S L，Ohsawa M，et al.Kiss－1expression and metastin－like immunoreactivity in the rat brain［J］.J Comp Neurol，2005，481（3）：314－329.