蔣海萍，廖丹葵，孫建華，童張法

抗氧化肽HDHPVC和HEKVC的反應動力學及抗氧化能力評價方法

蔣海萍，廖丹葵*，孫建華，童張法

（廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004）

研究抗氧化肽His-Asp-His-Pro-Val-Cys（HDHPVC）、His-Glu-Lys-Val-Cys（HEKVC）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的反應動力學特性。3 種抗氧化肽的二級反應動力學常數(shù)k2、抗氧化還原能力（antiradical power，ARP）及化學計量數(shù)等結(jié)果表明，其清除DPPH自由基能力的排列順序為HEKVC＜HDHPVC＜GSH。通過比較3 種抗氧化肽在穩(wěn)定狀態(tài)及固定30 min反應時間條件下清除DPPH自由基能力檢測方法的差異，發(fā)現(xiàn)3 種抗氧化肽均屬于慢反應動力學行為，固定30 min反應時間所測得的半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）比穩(wěn)態(tài)條件下測得值偏大3～5 倍。該研究表明HDHPVC和HEKVC是一種優(yōu)良的天然抗氧化肽。

His-Asp-His-Pro-Val-Cys；His-Glu-Lys-Val-Cys；DPPH自由基；抗氧化；動力學

抗氧化肽是介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的肽類，可從動植物等蛋白中提取，具有有效的抑制或減緩自由基及其所產(chǎn)生的氧化連鎖反應的活性功能。一般用于評價體外抗氧化能力的方法主要分為抑制脂質(zhì)過氧化法（硫氰酸鐵法、過氧化值法和共軛二烯法等）、清除自由基法（2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）法、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、O2-·法和·OH法等）及金屬離子螯合能力法3 類[1]。其中，DPPH分子結(jié)構(gòu)中含有未成對電子，可以接受由抗氧化物質(zhì)提供的H原子，其分子結(jié)構(gòu)變?yōu)镈PPH-H而導致反應體系顏色變淺或變?yōu)辄S色，吸收值隨之減弱或消失，可以定量反映出物質(zhì)清除DPPH自由基能力[2-3]。因此，DPPH法常被用于檢測固定反應時間條件下的DPPH自由基剩余百分比含量，間接反映物質(zhì)的抗氧化能力[4-5]。

由于抗氧化物質(zhì)與DPPH自由基反應中可能存在各種不同的反應動力學行為，抑或由于反應的可逆性[6]，生成物DPPH-H發(fā)生逆反應轉(zhuǎn)化成DPPH自由基而導致不完全反應。Bondet等[6]研究表明丁香酚清除DPPH自由基反應的動力學及其可逆性；Goupy[7]、Cevallos-Casals[8]、Friaa[9]等分別研究了酚類抗氧化劑及VE與DPPH自由基之間的不同反應動力學行為；王俊等[10]研究發(fā)現(xiàn)聚烯烴抗氧化劑對DPPH自由基具有良好的清除作用，屬于一級反應；趙慧芳等[11]比較了VC、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、色素和黑莓果實水提物分別與DPPH自由基之間的反應動力學，發(fā)現(xiàn)不同抗氧化物與DPPH自由基的反應歷程差異較大。因此，有關(guān)DPPH自由基與各抗氧化物質(zhì)間的氫原子轉(zhuǎn)移反應動力學的研究越來越受關(guān)注。

然而，DPPH自由基和抗氧化物的反應動力學與DPPH自由基濃度之間存在非線性關(guān)系，這將大大影響到由傳統(tǒng)方法檢測的半數(shù)有效濃度（EC50）值的精確度[12]。且此法對光、氧氣及雜質(zhì)均敏感[13]；并依賴于所采用的溶劑體系[14]。因此，通過采用兩種不同檢測方法比較研究抗氧化肽與DPPH自由基反應，對正確的利用DPPH法評價抗氧化物的自由基清除能力具有重要意義。

本實驗運用DPPH法研究從藍圓鲹魚肉蛋白水解物中獲得的新型抗氧化肽His-Asp-His-Pro-Val-Cys（HDHPVC）、His-Glu-Lys-Val-Cys（HEKVC）的反應動力學過程，并與固定反應時間的傳統(tǒng)檢測方法進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍圓鲹魚肉蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解，酶解產(chǎn)物（抗氧化肽His-Asp-His-Pro-Val-Cys （HDHPVC）和His-Glu-Lys-Val-Cys （HEKVC））經(jīng)分離純化鑒定獲得氨基酸序列結(jié)構(gòu)[15]，由上海吉爾生化有限公司合成（經(jīng)高效液相色譜法鑒定其純度98%以上）。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司；還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced，GSH） 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

BS-110S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-2550型紫外分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基反應性質(zhì)研究及標準曲線的繪制

取濃度為0.05 mmol/L的DPPH 50%甲醇溶液及GSH-DPPH 50%甲醇反應液分別于300～800 nm波長范圍內(nèi)掃描吸收峰。

精確稱取DPPH標準品4.9 mg，用50%甲醇溶液配制濃度為0.5 mmol/L的DPPH標準品母液，分別稀釋至0.0125～0.1 mmol/L不同濃度范圍，于515 nm波長處測定吸光度。

1.3.2 固定30 min反應時間測定抗氧化肽對DPPH自由基的清除能力

將0.5 mL待測樣品置于試管中，加入0.5 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L，溶于甲醇），振蕩混勻，室溫下放置30 min后，于515 nm波長處測其吸光度（As），對照為DPPH甲醇溶液在測定波長處的吸光度（A0），待測樣品與甲醇的混合液在測定波長處的吸光度（A1）。自由基清除率按照公式（1）[16]計算。

1.3.3 抗氧化肽清除DPPH自由基的反應動力學

將0.5 mL不同濃度的抗氧化肽樣品置于試管中，加入0.5 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L，溶于甲醇）啟動反應并計時，于515 nm波長處測其吸光度隨時間的連續(xù)變化趨勢。

DPPH甲醇體系中，抗氧化物質(zhì)[AH]與[DPPH·]之間的氫原子轉(zhuǎn)移反應如方程（2）所示，其中反應活性較差的[A·]則可能同時與[DPPH·]和[A·]發(fā)生副反應如方程（3）和（4）所示[17-18]。

方程（2）的反應級數(shù)取決于反應物的濃度。本實驗中總反應溶液的[DPPH·]濃度固定為0.05 mmol/L。假定在反應初始階段（1～2 min），不發(fā)生可逆反應與副反應，當c[DPPH·]＜＜c[AH]，該反應方程式可以看作為擬一級反應，由式（5）可計算出擬一級反應速率常數(shù)值kobsd。

式中：[DPPH·]0表示DPPH自由基在t=0時的濃度/（mmol/L）；kobsd表示擬一級反應速率常數(shù)/s-1，可以由式（5）計算得到；[DPPH·]t表示DPPH自由基在t min時的濃度/（mmol/L）。

同時，由方程式（2）可以得到：

由式（6）可知一級反應速率常數(shù)與抗氧化物的濃度成線性關(guān)系，由此可求得二級反應速率常數(shù)k2。

活性保持率指在某一反應時刻，未參與反應的DPPH自由基濃度占初始總濃度的百分比[19]。

1.3.4 抗氧化能力參數(shù)計算

半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除反應達到平衡狀態(tài)時，清除50%的DPPH自由基所需要的抗氧化物的濃度。為了更清楚的表達，通常采用抗氧化還原能力（antiradical power，ARP）來表示抗氧化能力，可由式（7）計算。ARP值越大，則物質(zhì)的抗氧化能力越強。

化學計量數(shù)是評價物質(zhì)抗氧化能力的重要參數(shù)之一，數(shù)值上表示清除100%的DPPH自由基所消耗的抗氧化物質(zhì)的有效濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基反應性質(zhì)

采用紫外分光光度計掃描D P P H甲醇溶液及GSH-DPPH甲醇溶液在300～800 nm之間的吸光度曲線，如圖1所示。

圖1 DPPH及添加了GSH的DPPH溶液的吸收波長掃描圖Fig.1 Absorption spectra of DPPH and GSH-DPPH in methanol/water

由圖1可知，DPPH甲醇溶液和GSH-DPPH甲醇溶液在515 nm波長附近都有強吸收峰，而GSH-DPPH甲醇溶液中由于加入了抗氧化劑GSH，與DPPH自由基反應并消耗掉部分DPPH自由基，導致溶液紫色變淺或變?yōu)辄S色，其在515 nm波長附近的吸收峰強度相應地減弱或消失。

DPPH自由基濃度與吸光度之間標準曲線方程如式（8）所示，其中R2=0.999 4，說明二者之間線性關(guān)系良好。

式中：c為DPPH自由基濃度/（mmol/L）。

2.2 抗氧化肽與DPPH自由基的反應進程

以GSH作為對照物，不同濃度的抗氧化肽（GSH：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L；HEKVC：0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L；HDHPVC：0.05、0.1、0.15、0.2 mmol/L）與DPPH自由基（0.05 mmol/L）反應的進程曲線如圖2所示。

圖2 不同濃度抗氧化肽GSH、HEKVC和HDHPVC與DPPH自由基的反應動力學曲線Fig.2 Kinetic behavior of GSH, HEKVC and HDHPVC for the scavenging of DPPH radical

由圖2可知，未參加反應的DPPH自由基濃度隨著反應的不斷進行而逐漸減少。在反應開始的前10 min，剩余DPPH自由基濃度顯著下降，隨后呈現(xiàn)緩慢降低趨勢，直至反應完全并達到平衡狀態(tài)。同時，隨著抗氧化肽濃度的增大，反應達到平衡狀態(tài)所需要的時間越來越短。即添加的抗氧化肽越多，其與DPPH自由基反應的速度就越快。其中，當抗氧化物的添加濃度較低時（谷胱甘肽與DPPH自由基的濃度比為1～2，HEKVC與DPPH自由基的濃度比為2～4，HDHPVC與DPPH自由基的濃度比為1），即使反應時間延長至120 min，反應也未達到平衡。但是若適當增大抗氧化肽的濃度，其反應平衡時間可縮至30～60 min之間。根據(jù)各抗氧化物達到平衡狀態(tài)所需要的時間，可將其按反應動力學性質(zhì)分為慢（＞1 h）、中（30 min～1 h）、快（＜30 min）3 種[20]。由于上述3 種抗氧化物在不同濃度條件下達到反應平衡所需要的時間均處于30 min～2 h范圍或＞2 h，因此它們均歸屬于慢反應動力學行為。

2.3 二級反應速率常數(shù)

二級反應速率常數(shù)k2通常被認為與抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力有關(guān)，是抗氧化物質(zhì)清除DPPH自由基能力的另一種體現(xiàn)形式[21]。k2越大，即物質(zhì)的反應速率越快，其清除自由基能力越強。各抗氧化肽的擬一階反應速率常數(shù)kobsd與抗氧化物濃度的定量關(guān)系如圖3所示，由式（6）可得到3 種物質(zhì)的k2值。

圖3 擬一階反應速率常數(shù)kobsd與抗氧化物濃度的關(guān)系Fig.3 Plot of pseudo first order rate constant (kobsd) versus antioxidant concentration

表1 抗氧化肽與DPPH自由基反應的二階速率常數(shù)Table 1 Second-order rate constants for the reaction between DPPH radical and antioxidative peptides

由表1可知，R2值可以看出3 種抗氧化肽的擬一階速率常數(shù)與濃度之間的線性關(guān)系均良好。同時，對照物GSH的二級速率常數(shù)最大，HDHPVC次之，HEKVC的速率常數(shù)最小。即各抗氧化物清除DPPH自由基能力大小順序為GSH＞HDHPVC＞HEKVC。

2.4 EC50、ARP和化學計量數(shù)

圖4 抗氧化物GSH、HDHPVC、HEKVC在穩(wěn)定狀態(tài)下的EC50Fig.4 EC50of GSH, HDHPVC and HEKVC for scavenging DPPH free radicals at the steady state

由圖4可知，抗氧化物GSH、HDHPVC、HEKVC在穩(wěn)定狀態(tài)下的EC50值分別為0.12、0.18、0.29 mmol/L，其大小順序為HEKVC＞HDHPVC＞GSH。同時，ARP值為GSH＞HDHPVC＞HEKVC，EC50值越低，則ARP值越大，也就是說物質(zhì)的抗氧化能力越強。因此，對照物GSH的抗氧化能力最強，HEKVC最弱。

表2 抗氧化動力學參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of GSH, HDHPVC and HEKVC

由表2可知，對照物GSH的化學計量數(shù)最低，即理論上只需要0.24 mmol/L的GSH就可以清除100%的DPPH自由基。HDHPVC的化學計量數(shù)略高于GSH，為0.36 mmol/L；HEKVC的最大，為0.58 mmol/L。同時，抗氧化肽HDHPVC和HEKVC還原DPPH自由基能力均弱于GSH，同等條件下分別還原了2.78和1.72 分子的DPPH自由基，低于對照物GSH （4.17分子的DPPH自由基），說明其抗氧化能力大小順序為HEKVC＜HDHPVC＜GSH，與前述測得的ARP結(jié)果相吻合。

2.5 穩(wěn)態(tài)與固定反應時間（30 min）條件下的EC50值比較本實驗對HDHPVC和HEKVC兩種抗氧化肽在穩(wěn)定狀態(tài)及固定30 min反應時間條件下求得的EC50值進行比較，如表3所示。

表3 穩(wěn)態(tài)與固定30 min反應時間下EC50值的比較Table 3 EC50at the steady state at 30 min of reaction time

由表3可知，當固定反應時間30 min時測得HDHPVC的EC50值為31.0 μmol/L，是穩(wěn)態(tài)下的5 倍；同理HEKVC在固定30 min條件下的EC50值是穩(wěn)態(tài)下的4.7 倍；對照物GSH在固定30 min條件下的EC50值也比穩(wěn)態(tài)的大，約3.4 倍。各抗氧化肽于固定30 min反應時間下測得的EC50值均比穩(wěn)態(tài)條件下的大3～5 倍，這可能是由于3 種抗氧化肽均屬于慢反應動力學類型，不同濃度的抗氧化物與DPPH自由基反應達到平衡所需要的時間在10 min至16 h不等。在固定30 min反應時間的條件下，HDHPVC、HEKVC及GSH與DPPH自由基反應遠未達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此運用固定30 min反應時間的方法所測得的EC50值比穩(wěn)態(tài)條件下測得的EC50值偏大數(shù)倍，但3 種抗氧化肽之間抗氧化能力大小比較趨勢一致。

3 結(jié) 論

抗氧化肽HDHPVC與DPPH自由基反應的二級反應速率常數(shù)k2為2.0×10-5L/（μmol·s），稍遜于對照物GSH（k2為2.3×10-5L/（μmol·s）），約是HEKVC（k2為0.7×10-5L/（μmol·s））的3倍。其次，3 種抗氧化肽均屬于慢反應動力學性質(zhì)，其在固定30 min反應時間的方法所測得的EC50值（HDHPVC和HEKVC分別為31.0 μmol/L和67.7 μmol/L）比穩(wěn)態(tài)條件下測得的EC50值（HDHPVC和HEKVC分別為9 μmol/L和14.5 μmol/L）偏大3～5 倍。因此，可以考慮運用兩種方法測得值之間的相差倍數(shù)作為校正系數(shù)，在固定反應時間（30 min）實驗結(jié)果的基礎上，校正得到其穩(wěn)態(tài)下的EC50值，以便能更準確地反映物質(zhì)的抗氧化能力。該研究結(jié)果表明抗氧化肽HDHPVC和HEKVC具有一定的體外抗氧化能力，是一種優(yōu)良的天然抗氧化肽。同時，對其進行的相關(guān)動力學性質(zhì)研究反映了不同物質(zhì)清除DPPH自由基反應之間的差異，對準確評價物質(zhì)的抗氧化能力具有一定的指導意義。

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Kinetic Studies of DPPH Radical Scavenging Activity of Antioxidative Peptides HDHPVC and HEKVC

JIANG Hai-ping, LIAO Dan-kui*, SUN Jian-hua, TONG Zhang-fa

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)

The kinetic behavior of two antioxidative peptides, His-Asp-His-Pro-Val-Cys (HDHPVC) and His-Glu-Lys-Val-Cys (HEKVC), as well as glutathione (GSH) for their DPPH radical scavenging activity was investigated. Three kinetic parameters of the two antioxidative peptides, including second-order rate constant (k2), antiradical power (ARP) and stoichiometry were calculated and compared with those of GSH. Results showed that the antioxidative capacity was sequenced as HEKVC＜HDHPVC＜GSH. All of them were considered to belong to slow kinetics behavior and showed a 3-5 folds higher EC50than at the steady state. It is concluded that HDHPVC and HEKVC are excellent natural antioxidants.

His-Glu-Lys-Val-Cys; His-Glu-Lys-Val-Cys; DPPH free radical; antioxidant; kinetics

TS218；TS201.2

A

1002-6630（2014）17-0109-05

10.7506/spkx1002-6630-201417022

2013-09-11

廣西自然科學基金重點項目（2012GXNSFDA053004）；廣西理工科學實驗中心重點項目（LGZX201208）

蔣海萍（1986—），女，博士研究生，研究方向為功能活性物質(zhì)提取。E-mail：hpjiang2011@sina.com

*通信作者：廖丹葵（1967—），女，教授，博士，研究方向為精細化工、生物制品分離純化、生物功能材料。

E-mail：liaodk@gxu.edu.cn