尹永祺，吳進賢，劉春泉，李大婧，楊潤強，顧振新,*

玉米籽粒低氧脅迫發(fā)芽期間主要生理生化和γ-氨基丁酸含量變化

尹永祺1，吳進賢1，劉春泉2，李大婧2，楊潤強1，顧振新1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

以玉米籽粒為材料研究低氧脅迫下籽粒發(fā)芽過程中主要生理生化和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量變化，篩選出最適富集GABA的玉米品種。結果表明：5 個品種玉米籽粒在72 h低氧脅迫發(fā)芽期間，芽長增長15.5～26.3 mm，呼吸強度提高1.7～3.2 倍，干物質損失35.6%～40.6%，淀粉消耗15.5%～28.9%，還原糖和游離氨基酸含量分別增加1.7～4.7 倍和7.4～13.3 倍，GABA含量提高9.3～13.2 倍，不同品種玉米籽粒發(fā)芽能力和GABA富集量呈顯著差異，以京甜紫花糯（ZHN）品種發(fā)芽率最高，達到85.5%，且GABA富集量達到0.65 mg/g（以干質量計），ZHN是富集GABA的最適玉米品種。低氧脅迫下發(fā)芽玉米中GABA含量與芽長、呼吸強度、游離氨基酸呈極顯著正相關（P＜0.01），玉米經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽能提升玉米營養(yǎng)品質。

玉米籽粒；發(fā)芽；低氧脅迫；γ-氨基丁酸

玉米（Zea mays L.），又名玉米黍、棒子和苞谷等，系玉米黍屬一年生禾本科植物，是我國重要的糧食作物之一。玉米籽粒營養(yǎng)豐富，除含有蛋白質、脂肪和胡蘿卜素外，還富含不飽和脂肪酸、谷胱甘肽、膳食纖維、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[1]。但是玉米蛋白結構不合理，且人體對其消化吸收和利用率低[2]，因而玉米一直被視為“粗糧”，在食品工業(yè)中其利用率僅為6%[3]。發(fā)芽是改變谷物營養(yǎng)成分和抗營養(yǎng)因子的一種方法，其能提升玉米營養(yǎng)品質[4]，降低抗營養(yǎng)因子水平，改善口感，優(yōu)化食用加工性能[5]。據(jù)報道，粟谷[6]、糙米[7]、蠶豆[8]和大豆[9]等植物性食品原料在低氧[10]、鹽脅迫[11]及其聯(lián)合脅迫[12]等逆境條件下發(fā)芽后，其功能性保健成分γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量顯著增加。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質，已被國家衛(wèi)生部批準為新資源食品，具有改善大腦血液循環(huán)、降低血壓、治療癲癇和痛風等多種功效。然而，人工調控玉米籽粒脅迫發(fā)芽的相關研究還未見報道。本實驗以玉米籽粒為實驗材料，研究低氧脅迫下玉米發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分和GABA含量的變化，旨在通過逆境脅迫富集發(fā)芽玉米中GABA含量，以期為玉米保健功能性食品開發(fā)提供技術參考和理論依據(jù)，推動玉米深加工產(chǎn)業(yè)的科學化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用的5 個玉米品種特性及選育單位見表1。所有原料均購于2012年，收獲后封裝于密閉容器中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 玉米品種Table 1 Description of maize cultivars

G ABA標準品和對二甲氨基苯磺酰氯 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗設計

稱取成熟飽滿未破損的玉米籽粒，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，去離子水沖洗至pH值中性后置于培養(yǎng)箱中30 ℃黑暗條件下浸泡12 h，浸泡結束以去離子水為培養(yǎng)液，通入空氣（通氣量1.0 L/min），于30 ℃浸泡發(fā)芽3 d，每隔12 h取樣。玉米發(fā)芽期間，每隔12 h更換培養(yǎng)液，直至培養(yǎng)結束。發(fā)芽玉米取出用去離子水清洗并吸干表面水分。鮮樣用于測定發(fā)芽率、芽長和呼吸強度，干燥后的樣品經(jīng)磨粉機粉碎后，過60 目篩用于測定可溶性蛋白質、游離氨基酸、淀粉、還原糖和GABA含量。

1.3 測定指標與方法

芽長：隨機選取20 粒發(fā)芽玉米籽粒，用游標卡尺測定其芽長；發(fā)芽率：按照GB/T5520—2011《糧油檢驗籽粒發(fā)芽試驗》[13]測定；呼吸強度：參照鄭永華等[14]的方法測定，結果以干質量計；干物質含量：采用烘干恒重法[15]測定；還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法[15]測定，結果以干質量計；可溶性蛋白質含量：采用考馬斯亮藍G-250法[15]測定，結果以干質量計；游離氨基酸含量：采用茚三酮溶液顯色法[15]測定，結果以干質量計；GABA含量：參照Bai Qingyun等[11]的方法測定，結果以干質量計。

2 結果與分析

2.1 不同品種玉米低氧脅迫下主要理化指標和GABA的含量

2.1.1 發(fā)芽率

圖1 不同品種玉米低氧脅迫下發(fā)芽率變化Fig.1 Germination rate of maize cultivars after germination under hypoxia

由圖1可知，低氧脅迫發(fā)芽72 h時，各品種玉米的發(fā)芽率具有顯著性差異。ZHN玉米的發(fā)芽率最高，達85.5%；其次為ZY，發(fā)芽率為82.7%；而玉米SYN-11、SY-1和SY-24的發(fā)芽率較ZHN玉米均顯著降低，其中玉米SY-24的發(fā)芽率僅為69%。

2.1.2 芽長

圖2 不同品種玉米低氧脅迫下發(fā)芽后的芽長Fig.2 Sprout length of maize cultivars after germination under hypoxia

由圖2可知，經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h后，各品種玉米的芽長具有顯著性差異。ZY品種芽長最長，達26.3 mm，分別是SYN-11、SY-1和SY-24品種芽長的1.3、1.6 倍和1.7 倍。

2.1.3 呼吸強度

圖3 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間呼吸強度的變化Fig.3 Change in respiratory rate of maize cultivars during germination under hypoxia

由圖3可知，低氧脅迫發(fā)芽0～72 h范圍內，各品種玉米的呼吸強度變化趨勢一致，其均隨發(fā)芽時間的延長呈先下降后持續(xù)增強的趨勢。發(fā)芽期間SY-24品種呼吸強度增幅最大，其次是ZY，而SYN-11、SY-1和ZHN發(fā)芽期間呼吸強度較低。發(fā)芽72 h時，5 種品種玉米呼吸強度比發(fā)芽前升高1.7～3.2 倍。玉米呼吸強度變化與其芽長變化趨勢一致，其呈極顯著正相關（r=0.921，P＜0.05）。

2.1.4 干物質含量

圖4 玉米低氧脅迫發(fā)芽過程中干物質含量變化Fig.4 Change in dry matter of five maize cultivars during germination under hypoxia

由圖4可知，低氧脅迫發(fā)芽0～72 h范圍內，各品種玉米的干物質含量變化趨勢一致，其均隨發(fā)芽時間的延長持續(xù)下降。發(fā)芽72 h時，5 個品種玉米干物質含量僅為發(fā)芽前的59.4%～64.4%。

2.1.5 可溶性蛋白質含量

圖5 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間可溶性蛋白質含量的變化Fig.5 Change in soluble protein content of maize cultivars during germination under hypoxia

由圖5可知，在72 h的發(fā)芽期內，5 個品種玉米中可溶性蛋白質含量變化均呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，但各品種可溶性蛋白質含量達到峰值的時間存在差異。ZHN和ZY品種發(fā)芽24 h內含量增加，隨后含量有所下降，48 h后均緩慢增加，發(fā)芽72 h時分別達到22.45、25.87 mg/g干質量。而SYN-11品種在36 h 時含量即達到最高，之后趨于穩(wěn)定，SY-1發(fā)芽期間其48 h時可溶性蛋白質含量最高。

2.1.6 游離氨基酸含量

圖6 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間游離氨基酸含量的變化Fig.6 Change in free amino acid content of maize cultivars during germination under hypoxia

由圖6可知，玉米發(fā)芽期間游離氨基酸含量均呈持續(xù)增加趨勢。發(fā)芽72 h時，SYN-11品種的游離氨基酸含量最高達11.98 mg N/g，其次依次為品種ZY、ZHN、SY-1和SY-24，其氨基酸含量分別為發(fā)芽初始的11.5、11.6、9.2、7.4 倍和13.3 倍，表明玉米經(jīng)發(fā)芽可改善玉米蛋白品質并增加游離氨基酸含量。

2.1.7 淀粉含量

圖7 玉米低氧脅迫發(fā)芽過程中淀粉含量的變化Fig.7 Change in starch content of maize cultivars during germination under hypoxia

由圖7可知，發(fā)芽初始各品種玉米中淀粉含量存在差異，其后隨發(fā)芽時間的延長均成持續(xù)下降趨勢。低氧脅迫發(fā)芽72 h后，品種ZY淀粉含量最高，5 種玉米淀粉消耗率達15.5%～28.9%。

2.1.8 還原糖含量

由圖8可知，同一發(fā)芽時間點不同品種玉米中還原糖含量存在差異，發(fā)芽期間各品種玉米還原糖含量較發(fā)芽初始時均增加。發(fā)芽72 h后5 種玉米中還原糖含量增加1.7～4.7 倍，其中SY-24在發(fā)芽36 h后還原糖含量即開始緩慢下降，其他品種則在60 h才開始有含量下降的現(xiàn)象發(fā)生，另外品種ZY和SYN-11的還原糖含量在發(fā)芽60 h時含量最高，分別是發(fā)芽0 h的4.4 倍和4.1 倍。

圖8 玉米發(fā)芽過程中還原糖含量變化Fig.8 Change in reducing sugar of maize cultivars during germination under hypoxia

2.1.9 GABA含量

圖9 玉米低氧脅迫發(fā)芽期間GABA含量的變化Fig.9 GABA content of maize cultivars after germination under hypoxia

由圖9可知，發(fā)芽72 h時，各品種玉米中GABA含量存在顯著性差異。ZHN品種玉米中GABA含量最高達0.65 mg/g，其較發(fā)芽初始增加13.2倍；ZY中的GABA含量為0.56 mg/g，增加12.9 倍；SYN-11、SY-24和SY-1品種玉米的GABA含量顯著低于ZHN和ZY品種。

2.2 玉米發(fā)芽生理生化指標和GABA含量的相關性分析

表2 發(fā)芽玉米生理指標和GABA含量的相關性分析Table 2 Correlation analysis between physiological indexes and GABA content in germinated maize

玉米發(fā)芽期間GABA含量提高，芽長增長，呼吸強度增加，可溶性蛋白質和游離氨基酸含量增加，這些指標的相關性分析結果見表2。品種ZHN在0～72 h低氧脅迫發(fā)芽期間，GABA含量與芽長、呼吸強度、游離氨基酸的相關系數(shù)r均高于0.90，呈極顯著正相關（P＜0.01），與可溶性蛋白質含量也呈顯著正相關（P＜0.05）。隨著發(fā)芽時間的延長，玉米芽長增長，呼吸強度增大，從而使干物質含量降低。同時，在蛋白酶的作用下，大分子的貯藏蛋白分解為小分子的可溶性蛋白質和游離氨基酸，這種變化有利于GABA的富集。

比較5 個玉米品種在低氧脅迫發(fā)芽72 h時的GABA含量與相關生理生化指標，可以權衡出品種ZHN在低氧脅迫條件下發(fā)芽富集GABA能力高于其他品種。故玉米ZHN可作為低氧脅迫富集GABA的良好材料。

3 討 論

低氧脅迫是指植物生長的環(huán)境中溶氧濃度低于正常大氣中濃度。植物在低氧環(huán)境中，其正常呼吸受到抑制，新陳代謝和生長速度減緩[9,16]。當電子傳遞鏈受到抑制后，糖類經(jīng)糖酵解途徑轉化為丙酮酸，然后生成乳酸和乙醇，導致細胞質酸化。存在于植物細胞質中谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）在酸性條件下被激活，催化Glu脫羧生成GABA，從而達到GABA富集的效果[17]。溶液中氧氣濃度較低，可以形成低氧環(huán)境。目前采用浸泡方式處理籽粒，形成低氧環(huán)境以達到富集GABA的目的。本實驗選擇30 ℃溫度、黑暗條件、去離子水浸泡并通以1.0 L/min空氣進行發(fā)芽，是一種低氧脅迫發(fā)芽方式。選擇最適發(fā)芽溫度（30 ℃）可避免不適當?shù)臏囟纫鸬碾p重脅迫。若選擇非最適溫度，逆境脅迫程度加深，玉米發(fā)芽率低且易致致死亡。選擇通氣量1.0 L/min條件是參考糙米[18]和蠶豆[19]發(fā)芽富集GABA通氣條件、結合玉米發(fā)芽預實驗以GABA含量為指標選擇的結果。

玉米籽粒呼吸增強是萌發(fā)過程中最顯著的生理變化之一。本實驗中5 個玉米品種的呼吸強度在萌發(fā)12 h后顯著增強，與報道的稻、麥等禾谷類種子變化趨勢一致。但是玉米在0～24 h階段呼吸強度是先減弱后增強的，這與玉米萌發(fā)初期無氧呼吸占主導地位的特點有關[2]。呼吸作用的增強表明玉米營養(yǎng)物質代謝旺盛，大量有機物質被酶分解消耗，這正是本研究中干物質含量在玉米發(fā)芽過程中逐漸降低的原因。劉娟等[4]研究表明，玉米正常發(fā)芽84 h時其干物質含量降至未發(fā)芽的50%左右，本實驗中干物質含量消耗速率較正常發(fā)芽低，這與低氧脅迫下呼吸作用被抑制有關?？扇苄缘鞍踪|與游離氨基酸關系緊密，可溶性蛋白質在發(fā)芽期間含量增高可推測是酶系統(tǒng)的組建和完成，這驗證了薛云皓等[20]得出玉米發(fā)芽期間可溶性蛋白質含量逐漸增的結果。游離氨基酸含量大幅度增加，可視為貯藏蛋白在蛋白酶作用下消解的結果以及新蛋白物質合成的開啟。此外，可溶性蛋白質與游離氨基酸的含量變化，促進了相關酶活性增加、增加了合成GABA的底物形成。發(fā)芽過程中在淀粉含量減少的同時還原糖含量增加，這有利于玉米營養(yǎng)被人體吸收利用和食用品質的改善[21-22]。

根據(jù)芽長與GABA相關性分析發(fā)現(xiàn)，芽長與GABA相關性高達0.94，呈現(xiàn)顯著相關性。糙米[23]和粟谷[24]中GABA含量與芽長也均呈顯著正相關。芽體長則表明玉米生理狀態(tài)良好，此時GABA富集量高，這表明GABA是植物、特別是新生植物抵御脅迫的重要調節(jié)因子[25]。可溶性蛋白質和游離氨基酸也與GABA呈正相關。因此，不同品種玉米可溶性蛋白質和游離氨基酸含量差異也會導致GABA含量差異。推測可溶性蛋白質含量在一定程度上反映了酶的活性，其含量增加則酶促反應程度高，而氨基酸含量的提高為GABA富集提供了充足的底物，因而促進了GABA的富集。

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Changes in Physio-biochemical Indexes and γ-Aminobutyric Acid Content during Germination of Maize (Zea mays L.) under Hypoxia Stress

YIN Yong-qi1, WU Jin-xian1, LIU Chun-quan2, LI Da-jing2, YANG Run-qiang1, GU Zhen-xin1,*
(1. Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The changes in physio-biochemical indexes and γ-aminobutyric acid (GABA) content during germination of five maize cultivars under hypoxia stress were investigated. Results showed the physiological and biochemical indexes of five maize cultivars significantly changed during 72 h germination under hypoxia. At the end of germination, the sprout length increased to 15.5-26.3 mm, the respiratory rate was improved by 1.7-3.2 folds, the dry matter was lost by 35.6%-40.6%, the starch content was consumed by 15.5%-28.9%, and the content of reducing sugar and free amino acids increased by 1.7-4.7 and 7.4-13.3 folds, respectively. GABA content in germinated maize increased by 9.3-13.2 folds when compared with the original maize. Furthermore, significant differences in GABA content and germination rate among different maize cultivars during germination were observed. Germination rate of cultivar ZHN was the highest (85.5%) with a maximum GABA content of 0.65 mg/g md. Hence, ZHN could be considered as a good source for GABA accumulation. GABA content in maize during germination under hypoxia revealed a significantly (P ＜ 0.01) positive correlation with sprout length, respiration rate and free amino acid content, respectively. The nutritional quality of maize could be improved through germination under hypoxia stress.

maize; germination; hypoxia stress; γ-aminobutyric acid

TS210.1

A

1002-6630（2014）17-0104-05

10.7506/spkx1002-6630-201417021

2013-08-23

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（11）2067）

尹永祺（1988—），男，博士研究生，研究方向為食品中功能成分的富集技術。E-mail：2011208009@njau.edu.cn

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向為生物技術與功能食品。E-mail：guzx@njau.edu.cn