楊慧娟，韓敏義，鄒玉峰，徐幸蓮，周光宏

低場核磁共振研究高壓處理對乳化腸特性的影響

楊慧娟，韓敏義，鄒玉峰，徐幸蓮，周光宏*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

以低溫乳化腸為材料，對0.1～400 MPa壓力處理組肉糜進行掃描電鏡觀察和低場核磁共振檢測，評估加熱后的感官特性，并進行相關(guān)性分析，從顯微結(jié)構(gòu)和水分子弛豫特性變化角度揭示高壓處理對乳化腸感官特性改善的原因。結(jié)果表明：與對照組相比，壓力從100 MPa增大到200 MPa，感官特性得分增加，而200 MPa到400 MPa得分減?。≒＜0.05）；掃描電鏡結(jié)果顯示各組肉糜顯微結(jié)構(gòu)存在明顯差異；T2弛豫結(jié)果顯示，實驗組T21峰面積大于對照組而T22峰面積小于對照組（P＜0.05），T21弛豫時間在壓力從100 MPa增大到200 MPa過程中升高，而在200 MPa到400 MPa降低（P＜0.05）；相關(guān)性分析表明，感官特性各指標與T21弛豫時間及其峰面積正相關(guān)，與T22峰面積負相關(guān)（P＜0.05）。因此，高壓處理使自由水部分轉(zhuǎn)化為不易流動水，并影響不易流動水與肉糜蛋白的結(jié)合程度，而轉(zhuǎn)化比例和結(jié)合程度的強弱又會顯著影響肉糜微結(jié)構(gòu)及其加熱后的感官特性。

高壓處理；低場核磁；橫向弛豫；顯微結(jié)構(gòu)

乳化腸由于營養(yǎng)美味、食用方便等特點深受消費者喜愛，但是加工過程中容易因操作不當(dāng)、生產(chǎn)條件控制不嚴等導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)保油保水性差、質(zhì)構(gòu)不理想等問題，直接表現(xiàn)為感官特性不佳[1-2]。除采用傳統(tǒng)工藝解決這些問題外，還可以采用高壓等新技術(shù)[3]。高壓處理（high pressure processing，HPP）是一種新型非熱殺菌技術(shù)，有著殺菌、滅酶、延長貨架期及改善產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)等特點而被廣泛應(yīng)用在多個研究領(lǐng)域[4]。

作為主要成分（約占75%），水分以一定數(shù)量定位、定向地存在于肉及肉制品中。水分子存在狀態(tài)及其流動性能不僅影響肌肉蛋白對油脂的乳化結(jié)合能力，也會對加熱后肉制品的產(chǎn)品外觀[5]、微生物腐敗敏感性[6]、保油保水和黏彈性[7]產(chǎn)生很大影響。從水分子的角度開展肌肉蛋白凝膠和乳化形成機制的研究逐漸成為國際肉品科研領(lǐng)域的一個主流趨勢。

低場核磁共振技術(shù)（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）因其無破壞性、制樣方便、測定快速、精度高、重現(xiàn)性好而在食品科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，近幾年來國內(nèi)外在通過利用LF-NMR鑒定食品中的水分、碳水化合物、蛋白質(zhì)、油脂及品質(zhì)等而鑒別食品中的摻雜摻假問題有較多的報道[8]。目前，LF-NMR在肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用主要集中在肉和肉制品中的水分含量和保水性，肌原纖維蛋白凝膠性和變性，脂肪和質(zhì)構(gòu)特性測定等方面[9-11]，但不同超高壓壓力處理對乳化腸水分分布影響的研究尚待深入研究。因此本實驗利用LF-NMR對HPP處理后的乳化腸水分分布進行初步探究，試從肉糜體系中的水分分布角度和微觀結(jié)構(gòu)揭示高壓處理改善乳化腸感官特性的原因，為今后該技術(shù)用于低溫乳化腸新產(chǎn)品研發(fā)過程中的品質(zhì)形成機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宰后24 h的豬后腿精瘦肉和豬肉肥膘均購于蘇食集團；食鹽、白胡椒粉等食用級添加劑 市售。

聚酰胺/聚乙烯真空包裝袋（2 0 ℃透氧率為1 cm3/（m2·h）） 北京華盾塑料有限公司；膠原蛋白腸衣 梧州神冠蛋白腸衣有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-IL-100-850-9-W高壓設(shè)備 英國Stansted Fluid Power公司；AUY120萬分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SANYO SIM-F124制冰機 日本三洋公司；ASC-30電子秤 沈陽朝陽衡器廠；DHG-903385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機 上海新苗醫(yī)療器械公司；BZBJ-15斬拌機 嘉興艾博不銹鋼機械工程有限公司；NiumagPQ001型核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；TC12E絞肉機 意大利Sirman公司；VF608灌腸機 德國Handtman公司；DC-800真空包裝機美國希悅爾公司；HH-42快速恒溫數(shù)顯水浴箱 常州國華電器有限公司；S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 肉糜制備

1.3.1.1 工藝配方及流程

參照Sikes等[12]的方法，稍加改動。瘦肉1 500 g、肥肉480 g，其他添加為冰水408 g、食鹽24 g、白胡椒粉15.6 g等。先進行原料肉整理（瘦肉和肥肉分別用絞肉機絞碎）；將瘦肉在1 500 r/min斬拌0.5 min；加鹽和總量的2/3冰水，繼續(xù)在3 000 r/min斬拌1 min；停2 min，便于鹽溶性蛋白的溶出；再加入脂肪和白胡椒粉等香辛料及剩余總量的1/3冰水，在1 500 r/min斬拌1 min；繼續(xù)在3 000 r/min斬拌1～1.5 min；將斬拌得黏彈性較好的肉糜裝入腸衣中（整個斬拌溫度控制在10 ℃左右）；在不高于20 ℃的室溫條件下選用不同壓力對肉糜進行處理即得到樣品，超高壓處理的時間和溫度分別為2 min和10 ℃。

1.3.1.2 實驗設(shè)計

根據(jù)壓力不同將樣品分為5 組：0.1 MPa（大氣壓強）對照組和100、200、300、400 MPa高壓處理組。樣品在10 ℃左右的高壓腔體內(nèi)處理2 min，對照組則置于10 ℃水浴中浸泡2 min。處理后再將樣品分成兩部分，一部分真空包裝后4 ℃冷藏進行低場核磁共振測定、掃描電鏡指標分析用，其余進行蒸煮（水溫為80 ℃，當(dāng)樣品中心溫度達到72 ℃保持15 min），冷卻用于感官指標評定。實驗完全重復(fù)3 次，每次實驗都需重新采集宰后24 h的原料肉（共使用4.5 kg）。感官評定和低場核磁共振等指標每次測定都需要有3 個以上的平行樣。

1.3.2 感官評定

參照Zamri等[13]的方法，稍加改動。由10 名感官評定人員對經(jīng)蒸煮的肉糜的質(zhì)構(gòu)、外觀和整體可接受度進行評分。評分標準見表1。

表1 感官評定評分標準Table 1 Standards for sensory evaluation

1.3.3 NMR自旋-自旋弛豫時間（T2）測定

NMR弛豫測量在核磁共振成像分析儀上進行。測試條件為：質(zhì)子共振頻率為22 MHz，測量溫度為32 ℃。大約2 g樣品放入直徑15 mm核磁管中，而后放入分析儀中。90°脈沖和180°脈沖之間的時間為250 μs。重復(fù)掃描32 次，重復(fù)間隔時間為6.5 s得到12 000 個回波，得到的圖為指數(shù)衰減圖形，每個測試有4 個重復(fù)。自旋-自旋弛豫時間T2用CPMG脈沖序列進行測量，弛豫圖每個組分峰值對應(yīng)的時間作為T2。

1.3.4 掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

將肉糜樣品切片后用2.5%戊二醛溶液固定，取樣成1 cm×1 cm×1 cm大小后并用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）漂洗數(shù)次，用1%的四氧化鋨固定，再用同樣的緩沖液漂洗，然后用乙醇梯度脫水，冷凍干燥，噴金鍍膜后于掃描電鏡（scanning electron micrograph，SEM）觀察微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為15 kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將數(shù)據(jù)輸入到SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中，先進行一般描述性統(tǒng)計，然后再進行方差分析（用鄧肯新復(fù)極差法進行多重比較）和雙變量相關(guān)分析，并得到相關(guān)系數(shù)矩陣。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓力處理對乳化腸感官評定的影響

表2 10 ℃不同壓力作用2 min的乳化腸感官評分（x±s，n=3）Table 2 Sensory evaluation of sausages treated with various HPP for 2 min at 10 ℃ (x±s，n= 3)

由表2可知，乳化腸質(zhì)構(gòu)、外觀及整體可接受度隨作用壓力增大呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。與對照組相比，高壓組的質(zhì)構(gòu)、外觀及整體可接受度的得分都顯著提高。200 MPa處理的樣品各得分均達到最大值，質(zhì)構(gòu)、外觀及整體可接受度的得分均高于9.50。超過200 MPa后隨壓力增大，感官特性各指標得分均顯著下降（P＜0.05）。

肌肉的各種食用品質(zhì)尤其是感官品質(zhì)特性（嫩度、風(fēng)味、多汁性等）受肌纖維組織化學(xué)特性的影響[14]。Tintchev等[15]研究表明200 MPa是高壓改善原料肉食用品質(zhì)的臨界值，低于200 MPa處理時肉的外觀和組織結(jié)構(gòu)變化不大，這可能是由于200 MPa以上的壓力處理容易引起肌纖維結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子低聚物的解聚，導(dǎo)致伸縮及在疏水殘基周圍形成籠狀物，該結(jié)構(gòu)有利于水分子的吸附。該原理可以解釋大于200 MPa處理時樣品的蒸煮損失能顯著降低，而100 MPa處理組卻觀察不到該現(xiàn)象[16-17]。本實驗結(jié)果與該文獻的結(jié)論一致。但如果作用壓力過大，反而不利于乳化肉糜復(fù)合凝膠的保油保水性。Lindahl等[18]的研究表明，高壓作用時間相同情況下分別以400～600 MPa高壓處理，豬肉糜蛋白凝膠的汁液損失隨壓力升高顯著增加，這可能是由于肉糜體系復(fù)合溶膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的的自由態(tài)水分子與肌肉蛋白分子的結(jié)合程度會隨著高壓作用壓力增大而減弱，因為壓力增大會使肌纖維結(jié)構(gòu)更緊實從而導(dǎo)致該部分自由水流失增加，該結(jié)果也證實了本研究中高壓作用壓力過高情況下可能會因汁液損失增加流失而降低影響感官評價中的口感特性。

2.2 弛豫特性

弛豫時間T2可以反映水分的自由度，弛豫時間的變化表征經(jīng)不同壓力處理后肉糜中存在的多種狀態(tài)水分群的分布情況，即各狀態(tài)下水分的結(jié)合狀態(tài)和自由移動程度；而弛豫峰面積百分數(shù)可以估算氫質(zhì)子的相對含量，從而反映各種狀態(tài)水分群的含量，其變化可以表征經(jīng)不同壓力處理后肉糜中各種狀態(tài)水分子的含量變化情況，即各種狀態(tài)水分子群的流動轉(zhuǎn)移情況。由圖1可知，弛豫時間T2分布呈現(xiàn)3 個峰：0～10、10～100、100～1 000 ms。根據(jù)出峰時間及各峰所占總面積的百分比，認為3 個峰分別對應(yīng)于水的3 個組分，即結(jié)合水（T2b）、不易流動水（T21）和自由水（T22）[19]。表3為不同超高壓壓力處理下肉糜中水分子T2弛豫時間的變化。

圖1 200 MPa高壓處理后肉糜橫向弛豫時間T2分布Fig.1 Distribution of transverse relaxation time in meat batters treated at 200 MPa

表3 10 ℃不同壓力處理2 min肉糜的低場核磁共振弛豫時間變化x±s，n=3）Table 3 Effect of HPP treatment for 2 min at 10 ℃ on T2 of water from meat batters (x±s，n= 3)

由表3可知，肉糜中自由水受高壓作用影響較大，與對照組相比，第1個峰對應(yīng)的T2弛豫時間（T2b）和第2個峰對應(yīng)的T2弛豫時間（T21）均先向慢弛豫方向移動，再向快弛豫方向移動，其中T2b差異不顯著（P＞0.05），而T2b差異顯著（P＜0.05）。隨著壓力增加，第3個峰對應(yīng)的T2弛豫時間（T22）向慢弛豫方向移動，T22從對照組的278.87 ms下降到400 MPa組的353.40 ms，表明高壓處理可以使肉糜中自由水與肌肉蛋白質(zhì)分子的結(jié)合度減弱，該部分水分子的自由度增加（P＜0.05）。如果隨著壓力增大肉糜體系中自由態(tài)水分子的弛豫速率持續(xù)降低，T2弛豫時間顯著增大，會一直增強該部分水的移動性，可能會導(dǎo)致肉糜體系的穩(wěn)定性下降，引起加熱后樣品的汁液損失增加并最終影響到產(chǎn)品的口感等食用品質(zhì)。

由表4可知，與對照組相比，不同壓力處理使第1個和第2個峰面積百分數(shù)顯著增加（P＜0.05）。而隨著作用壓力增大，第3個峰的峰面積百分數(shù)顯著下降（P＜0.05），從對照組的4.03%下降到400 MPa作用壓力下的0.35%。由上述3 個峰的峰面積百分數(shù)變化可知，高壓處理顯著影響各狀態(tài)下水分子的分布情況，且隨著壓力的增加，代表自由水的峰面積百分數(shù)降低，而代表結(jié)合水和不易流動水的峰面積百分數(shù)升高。說明高壓作用能使肉糜中的自由水向結(jié)合水和不易流動水轉(zhuǎn)化。

表4 10 ℃不同壓力處理2 min肉糜的低場核磁弛豫峰面積百分數(shù)變化（x ±s,, n =7）Table 4 Effect of HPP treatment for 2 min at 10 ℃ on T2 peak area fraction of water from meat batters (x ±s,, n = 7)

研究[20-23]表明，合適參數(shù)的高壓處理能提高豬肉乳化肉糜復(fù)合凝膠的保水性，這可能與高壓作用后的水分子團會使肉糜中的肌原纖維蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性并改變肌肉蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的鹽橋有關(guān)。一方面，超高壓能促使水分子發(fā)生聚合，縮短彼此間的距離，而蛋白質(zhì)大分子對壓力有一定的抵抗能力，仍可以使分子保持天然球狀結(jié)構(gòu)，這便于水分子等小分子發(fā)揮滲透和填充作用，讓自由水填補到蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈周圍而變成結(jié)合水，同時蛋白質(zhì)等生物大分子鏈在降壓過程中被拉長，分子的部分立體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞而致使蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性，也會利于極性親水基團與水分子的結(jié)合[24]；另一方面，超高壓作用會破壞二價陽離子與蛋白質(zhì)分子間的鍵合作用，導(dǎo)致添加食鹽肉糜體系中的肌肉蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生變化，不利于蛋白質(zhì)分子和陽離子間的鹽橋形成，也會使經(jīng)高壓處理后肌肉蛋白凝膠的保水性提高，從而改善口感等感官特性[25]。

2.3 水分分布特性與感官評定指標間的相關(guān)性分析

表5 水分分布特性與感官評定指標間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation between water distribution and sensory evaluation of meat batters

高壓處理可以改善乳化腸的感官特性可能與肉糜中水分分布情況有關(guān)。由表5可知，乳化腸的整體可接受度、外觀及質(zhì)構(gòu)與T21弛豫時間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.863、0.835和0.860，且整體可接受度、外觀及質(zhì)構(gòu)與T21弛豫峰面積百分數(shù)也顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.742、0.755和0.734；整體可接受度、外觀及質(zhì)構(gòu)和弛豫峰面積百分數(shù)T22呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.722、-0.731和-0.711。由相關(guān)性分析可得，感官特性各指標與T21弛豫時間和T21峰面積正相關(guān)，而與T22峰面積負相關(guān)（P＜0.05）。

高壓處理可以顯著影響乳化腸的感官評定指標得分及水分與蛋白的結(jié)合程度，促使自由水向結(jié)合水和不易流動水轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)化比例和結(jié)合程度的強弱又會顯著影響乳化腸肉糜微結(jié)構(gòu)及其加熱后的感官特性。由相關(guān)性分析的結(jié)果可以明顯發(fā)現(xiàn)，感官評定指標與水分子弛豫特性變化指標間存在著顯著相關(guān)性，不易流動水與蛋白的結(jié)合程度越高，不易流動水的比例增加，即自由水與蛋白的結(jié)合程度越弱，則感官評定指標得分就越高。

2.4 掃描電鏡觀察不同壓力處理肉糜的微觀結(jié)構(gòu)

圖2 掃描電鏡觀察高壓處理的肉糜超微結(jié)構(gòu)（×100）Fig.2 Microstructure of meat batters subjected to high pressure treatment observed under SEM (×100)

由圖2可知，與對照組相比，經(jīng)高壓處理的肉糜結(jié)構(gòu)比較緊湊，殘留的蛋白膜較少，當(dāng)作用壓力為400 MPa時，幾乎看不到明顯的蛋白膜殘留，而此時肉糜結(jié)構(gòu)的致密性較差。200 MPa壓力處理組的肉糜結(jié)構(gòu)比較緊湊及致密，體系中脂肪微粒分布和殘留的蛋白膜數(shù)量都較少，體現(xiàn)出良好的乳化性能，而且肉糜中的肌肉蛋白也呈現(xiàn)典型的均勻細膩、孔洞較少的三維立體溶膠結(jié)構(gòu)。

Trepalacios等[26]研究發(fā)現(xiàn)，合適壓力大小的高壓處理可以增大肌纖維的間隙，還能部分剝離肌纖維內(nèi)外周膜，認為這可能是高壓解聚肌動蛋白和肌動球蛋白，提高肌原纖維蛋白質(zhì)的溶解性，這樣對肉的組織結(jié)構(gòu)、保水性等都有改善作用，從而改善乳化腸的口感。而高壓處理對蛋白質(zhì)分子的4種結(jié)構(gòu)類型影響不同，對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)沒有影響，對二級結(jié)構(gòu)有一定的穩(wěn)定作用，對蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)卻有破壞和修飾作用[27]。與熱處理是通過破壞氫鍵并形成大量的二硫鍵和疏水交聯(lián)等導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性不同，高壓處理是通過破壞疏水鍵和離子鍵而促使蛋白質(zhì)分子天然結(jié)構(gòu)的解折疊，引起蛋白質(zhì)分子體積的變化從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[28]。而本實驗掃描電鏡顯微結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明，不同作用壓力會引起對蛋白質(zhì)分子發(fā)生不同程度或不同種類的變性，該現(xiàn)象對肌肉蛋白的凝膠乳化形成能力以及對最終肉糜體系物理化學(xué)特性的影響值得深入研究。

3 結(jié) 論

經(jīng)超高壓處理的肉糜體系中水分子的狀態(tài)分布發(fā)生顯著變化。隨著作用壓力從0.1 MPa（大氣壓強）增加到400 MPa，肉糜體系中自由水與肌肉蛋白的結(jié)合程度增減弱，自由水向不易流動水和結(jié)合水轉(zhuǎn)化，提高了乳化腸的感官特性評分結(jié)果；經(jīng)超高壓處理的肉糜體系，其微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，這可能是使體系中水分分布發(fā)生變化的原因之一。

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A Low-Field Nuclear Magnetic Resonance (LF-NMR) Study of Effect of High Pressure Processing on the Characteristics of Emulsion Type Sausages

YANG Hui-juan, HAN Min-yi, ZOU Yu-feng, XU Xing-lian, ZHOU Guang-hong*
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The present study investigated the effect of high pressure processing (HPP) (0.1, 100, 200, 300 and 400 MPa, 10 ℃, 2 min) on water distribution and microstructure of meat batters and sensory characteristics of sausages using sensory evaluation, low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) and scanning electron microscopy (SEM). The results revealed that the scores of sensory properties were significantly increased with increasing pressure from 100 to 200 MPa, but decreased as the pressure further rose to 400 MPa (P ＜ 0.05). In addition, HPP significantly changed the microstructure of meat batters. HPP resulted in a larger peak area of fast-relaxation time (T21), but a smaller peak area slow-relaxation time (T22) with increasing pressure level in meat batters when compared with the control samples. Moreover, the T21tended to first increase and then decrease with increasing pressure from 100 to 200 and further to 400 MPa (P ＜ 0.05). Furthermore, a significant positive correlation was observed between sensory evaluation scores and T2, as well as and T2peak area (P ＜ 0.05). In conclusion, the higher level vof immobilized water in the myofibrillar matrix caused by HPP can contributed to modify the microstructure of meat batters and improve sensory characteristics of cooked sausages.

high pressure processing; low-field nuclear magnetic resonance; T2relaxation time; microstructure

TS201.7

A

1002-6630（2014）17-0053-05

10.7506/spkx1002-6630-201417011

2013-09-03

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B03）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目（SX（2011）146）

楊慧娟（1989—），女，碩士研究生，研究方向為肉品質(zhì)量安全控制。E-mail：huijuanyang2012@gmai.com

*通信作者：周光宏（1960—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：ghzhou@njau.edu.cn