■楊 駿 陳生琴 王 婷 柳俊超 程茂基

（安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036）

眾所周知，我國是一個水果蔬菜原產地大國，從1993年起，中國水果總產量超過印度、巴西、美國，連續(xù)21年穩(wěn)居世界第一。我國現有的傳統(tǒng)的果蔬加工技術有罐裝、干制、腌制等，但這些技術在加工過程中果蔬的營養(yǎng)損失嚴重，且轉化率不高。近年來，國內外逐漸出現了幾種新的果蔬加工的方式，包括果蔬功能成分的提取、脫水等。利用我國傳承千年的發(fā)酵工藝，發(fā)酵果蔬產品，不僅最大限度的保留了果蔬中的營養(yǎng)成分，改進了果蔬食用價值，將之利用在飼料中，不僅可以提高飼料蛋白質含量等營養(yǎng)因子，還能消除飼料中原有的不良氣味，改善其適口性，增加畜禽采食量，提高飼料的營養(yǎng)價值。

近年來，國內外對發(fā)酵果蔬產品的研究不斷加大，發(fā)酵果蔬產品的功能型也不斷擴展，例如，發(fā)酵果蔬汁的一個典型保健功能就是調節(jié)胃腸道菌群，抑制有害菌的繁殖[1]。采用生物發(fā)酵技術應用于果蔬飲料和果蔬醬料的加工生產中，可有效改善蔬菜特有的“野蒿味”，使原料風味與發(fā)酵風味渾然一體，提高果蔬深加工產品的品質和營養(yǎng)價值，并且可有效防止果蔬醬發(fā)生褐變，還可使果蔬醬含糖量降低至10%以下[2]。大量資料顯示，果蔬磨成的漿液經乳酸菌發(fā)酵后，其營養(yǎng)成分得到了良好的保留和細化。

現今，發(fā)酵果蔬產品也廣泛應用于飼料工業(yè)，如楊福有、祁周約等[3-4]對蘋果渣的化學成分、喂養(yǎng)效果進行了初步研究,籍保平、徐抗震等[5-8]對蘋果渣發(fā)酵菌種選育、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進行了探討。蘋果渣發(fā)酵飼料作為蘋果渣的合理利用方式之一[9]，目前的研究多集中在提高蛋白質的含量方面[6,10-12]。此外利用液體飼料可緩解斷奶造成的應激，降低斷奶仔豬的腹瀉率，顯著提高飼料轉化率[13]，將果蔬原材料制成濃漿液后按比例加入液體飼料中發(fā)酵后，可增加飼料的芳香性氣味，進一步提高飼料采食量，增加斷奶仔豬的日增重。為此，本試驗擬以益生菌發(fā)酵果蔬液體飼料，研究益生菌發(fā)酵果蔬液體飼料前后營養(yǎng)成分的比較，以期為開發(fā)出一種綠色、環(huán)保、健康的新型生物飼料提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種：本實驗室保存的酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌。

1.1.2 果蔬產品選擇：選取新鮮的番茄、胡蘿卜、山楂、蘋果，購于合肥周谷堆批發(fā)市場。

1.1.3 培養(yǎng)基

①酵母菌培養(yǎng)基-馬鈴薯培養(yǎng)基

馬鈴薯去皮 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂粉 20 g，蒸餾水 1 000 ml，自然pH值；

②枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

蛋白胨 10 g、牛肉膏 3 g、NaCl 5 g、瓊脂粉 15～20 g，蒸餾水 1 000 ml，pH值7.4～7.6；

③植物乳桿菌培養(yǎng)基-MRS

蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出膏20 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、K2HPO42 g、七水合硫酸鎂0.2 g、硫酸錳 0.05 g、吐溫-80 1.0 g、瓊脂粉 20 g、NaCl 5 g，pH值7.0～7.2，蒸餾水 1 000 ml。

1.2 試驗方法

1.2.1 果蔬濃漿液的預處理

參照斷奶仔豬營養(yǎng)需求，將玉米、豆粕、麩皮等飼料原料與水混合，水料比2.5∶1，制成半成品液體飼料。后將等質量的番茄、胡蘿卜、山楂、蘋果（去皮、核），用勻漿機打碎后靜置，加少量水調制成濃漿升溫浸泡、滅菌、降溫后，加入配置好的液體飼料，加入比例為4%。待接入實驗菌種。

1.2.2 果蔬濃漿液體飼料發(fā)酵前指標的測定

接入菌種前測定果蔬濃漿液體飼料的粗蛋白、粗纖維、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

1.2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 酵母菌濃漿發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

將500 g濃漿液體飼料裝入密封塑料桶中（敞開封口并好氧發(fā)酵），置于振蕩培養(yǎng)箱中，以發(fā)酵溫度30℃、接種量2%、發(fā)酵時間60 h、pH值5的基礎上，分別考察發(fā)酵時間（24、36、48、60、72、84 h）、發(fā)酵溫度（27、28、29、30、31、32 ℃）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）、pH值（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）對果蔬濃漿液的影響。在單因素試驗的水平上，根據各因素對濃漿液體飼料中生物量的影響，設計4因素3水平正交試驗L9(34)，對發(fā)酵條件進行正交優(yōu)化試驗，確定酵母菌對濃漿液的最佳發(fā)酵組合條件。酵母菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平見表1，并在最佳優(yōu)化條件下測定其粗蛋白、粗纖維、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表1 酵母菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平

1.2.3.2 枯草芽孢桿菌濃漿發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

將500 g濃漿液體飼料裝入密封塑料桶中（敞開封口并好氧發(fā)酵），置于振蕩培養(yǎng)箱中，以發(fā)酵溫度30℃、接種量2%、發(fā)酵時間60 h、pH值5的基礎上，分別考察發(fā)酵時間（24、36、48、60、72、84 h）、發(fā)酵溫度（27、28、29、30、31、32 ℃）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）、pH值（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）對果蔬濃漿液的影響。在單因素試驗的水平上，根據各因素對濃漿液生物量的影響，設計4因素3水平正交試驗L9(34)，對發(fā)酵條件進行正交優(yōu)化試驗，確定枯草芽孢桿菌對濃漿液的最佳發(fā)酵組合條件?？莶菅挎邨U菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平見表2，并在最佳優(yōu)化條件下測定其粗蛋白、粗纖維、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表2 枯草芽孢桿菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平

1.2.3.3 植物乳桿菌濃漿發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

將500 g濃漿液體飼料裝入密封塑料桶中（厭氧發(fā)酵），置于振蕩培養(yǎng)箱中，以發(fā)酵溫度40℃、、接種量3%、發(fā)酵時間72 h、pH值5的基礎上，分別考察發(fā)酵時間（24、48、72、96、120 h）、發(fā)酵溫度（38、39、40、41、42℃）、接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）對果蔬濃漿液生物量的影響。在單因素試驗的水平上，根據各因素對濃漿液的影響，設計4因素3水平正交試驗L9(34)，對發(fā)酵條件進行正交優(yōu)化試驗，確定植物乳桿菌對濃漿液的最佳發(fā)酵組合條件。植物乳桿菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平見表3，并在最佳優(yōu)化條件下測定其粗蛋白、粗纖維、pH、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表3 植物乳桿菌濃漿發(fā)酵正交試驗因素水平

1.3 混菌發(fā)酵果蔬液體飼料發(fā)酵條件優(yōu)化實驗

將500 g(水料比2.5∶1)果蔬液體飼料裝入密封塑料桶中，總發(fā)酵時間分別為72 h、好氧厭氧發(fā)酵時間比例為1∶1，好氧期間溫度為30℃，厭氧期間溫度為40℃，三種菌的接種總量為10%，酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸菌接種量比例依次為3%、4%、3%，探究混菌發(fā)酵前后對果蔬液體飼料營養(yǎng)價值的影響。1.4 指標的測定

1.4.1 粗蛋白測定采用凱氏定氮法。

1.4.2 粗纖維測定方法。

1.4.3 乳酸的測定

發(fā)酵樣品預處理：取適量發(fā)酵樣品與等量的水混合均勻后，在5 000 r/min離心10 min，以除去菌體和碳酸鈣沉淀,吸取上清夜0.5 ml經適當稀釋后，吸取上清液2 ml于潔凈離心管中，加入2 ml鎢酸溶液，混勻，室溫靜置，直至溶液中出現明顯絮狀物，10 000 r/min離心10 min，取上清夜置于10 min潔凈離心管中，60℃水浴保溫30 min左右，冷卻待用。

發(fā)酵樣品測定：精確吸取5 ml待測液于具塞試管中，加入0.05 g氫氧化鈣，混勻，然后加入0.8 m1 20%的硫酸銅，迅速混勻，沸水浴3 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 ml于比色管中加入6 ml濃硫酸，混勻，沸水浴加熱5 min，取出后冰水浴冷卻加入1.5%的對羥基聯苯溶液0.125 ml，充分混合,靜置30 min置于沸水浴加熱5 min，冰水浴冷卻，以蒸餾水為參比液，在565 nm處測定其吸光度。

1.4.4 生物量的測定

無菌稱取樣品25.0 ml，放入含有225 ml稀釋液的滅菌三角瓶中，充分振蕩20～30 min后，制成10-1的稀釋液。用移液槍吸取10-1稀釋液1 ml于9 ml稀釋液的1號試管中，混合均勻，制成10-2稀釋液，依次制成10-2～10-3不同梯度的稀釋液（每做1個稀釋度都必須更換1個槍頭）。每個樣品選2個稀釋度，取1 ml菌懸液于相應編號的無菌平皿內，每個稀釋度做2個平皿，再倒入已冷至45℃的各自培養(yǎng)基15～20 ml，邊倒邊搖，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后計數。

1.4.5 鈣、磷的測定參照張麗英《飼料分析及飼料質量檢測技術》的方法檢測。

1.4.6 pH值的測定使用STARTER 300型便攜pH計測定上清液pH值。

2 結果與分析

2.1 酵母菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的優(yōu)化

酵母菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的正交試驗和方差分析見表4～表6。

由表4的正交試驗可以看出，影響發(fā)酵效果中生物量的4個主要因素的主次順序是：時間＞溫度＞pH值＞接種量，最佳組合是：A2B2D3C3。即最佳優(yōu)化條件為發(fā)酵時間60 h、溫度30℃、pH值6.0、接種量3%。

其中發(fā)酵時間對酵母菌生物量的影響有顯著差異（P＜0.05），濃漿液飼料在發(fā)酵時間達到72 h后，發(fā)酵液底物中的營業(yè)物質也被大量消耗從而不能滿足酵母菌的生長需要，微生物生長進入穩(wěn)定期。而發(fā)酵溫度、接種量、pH值則對酵母菌生物量的影響不顯著（P＞0.05）。

表4 酵母菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件正交試驗的直觀分析

表5 方差分析

在最佳優(yōu)化條件下，即發(fā)酵時間60 h、溫度30℃、pH值6.0、接種量3%的條件下的酵母菌生物量為91.54×106cfu/ml（見表6），此外粗蛋白含量比發(fā)酵前上升6.59%，粗纖維含量減小20.83%，乳酸含量增加約7.38倍，鈣、磷含量也有不同程度的增加。

表6 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

2.2 枯草芽孢桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的優(yōu)化

枯草芽孢桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的正交試驗和方差分析見表7～表9。

表7 枯草芽孢桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件正交試驗的直觀分析

由表7的正交試驗可以看出，影響發(fā)酵效果中生物量的4個主要因素的主次順序是：溫度＞發(fā)酵時間＞pH值＞接種量，最佳組合是：B2A2D2C3。即最佳優(yōu)化條件為溫度30℃、發(fā)酵時間60 h、pH值5、接種量4%。

結果表明，發(fā)酵溫度和時間對枯草芽孢桿菌的微生物量影響有顯著差異（P＜0.05），其中發(fā)酵溫度對生物量的影響最顯著。而pH值、接種量對枯草芽孢桿菌的微生物量的影響不顯著（P＞0.05）。影響枯草芽孢桿菌的生物量因素的主次順序是：溫度＞發(fā)酵時間＞pH值＞接種量，這與正交試驗的極差分析結果相吻合。

表8 方差分析

在最佳優(yōu)化條件下，即溫度30℃、發(fā)酵時間60 h、pH值5、接種量4%的條件下的枯草芽孢桿菌生物量為126.39×106cfu/ml（見表9），此外粗蛋白含量比發(fā)酵前上升8.24%，粗纖維含量減小12.5%，乳酸含量成幾何倍數增加，鈣、磷含量同樣也有不同程度的增加。

表9 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

2.3 植物乳桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的優(yōu)化

植物乳桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件的正交試驗和方差分析見表10～表12。

表10 植物乳桿菌濃漿液體飼料發(fā)酵條件正交試驗的直觀分析

表11 方差分析

表12 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

由表10的正交試驗可以看出，影響發(fā)酵效果中生物量的4個主要因素的主次順序是：發(fā)酵時間＞溫度＞pH值＞接種量，最佳組合是：A2B2C3D3。即最佳優(yōu)化條件為發(fā)酵時間60 h、溫度40℃、接種量3%、pH值6。

其中，發(fā)酵時間和溫度對植物乳桿菌的微生物量影響均有顯著差異（P＜0.05），其中發(fā)酵時間對生物量的影響最顯著。影響植物乳桿菌的微生物量因素的主次順序是：發(fā)酵時間＞溫度＞接種量＞pH值，這與正交試驗的極差分析結果相吻合。

在最佳優(yōu)化條件下，即發(fā)酵時間60 h、溫度40℃、接種量3%、pH值6的條件下的植物乳桿菌生物量為92.28×106cfu/ml（見表12），此外粗蛋白含量比發(fā)酵前上升6.43%，粗纖維含量減小10.22%，乳酸含量成幾何倍數增加，鈣含量上升64%，磷含量上升28.57%。

2.4 混菌發(fā)酵對果蔬液體發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值的影響

表13 混菌發(fā)酵前后果蔬液體發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值對比

經好氧厭氧混菌發(fā)酵后，果蔬液體飼料的營養(yǎng)價值比發(fā)酵前有了明顯的提高（見表13），其中發(fā)酵后粗蛋白含量達到19.88%，比發(fā)酵前提高9.2%，比單個菌種發(fā)酵的粗蛋白含量最大值高；粗纖維含量比發(fā)酵前降低，含量達到2.01%；此外乳酸、生物量、Ca、P也有明顯的提升，分別提高至 61.88 g/l、162.73×106cfu/ml、0.99%和0.91%。

3 討論

3.1 發(fā)酵時間是影響液體發(fā)酵飼料粗蛋白含量的主要條件，發(fā)酵時間過短不利于微生物的生長繁殖，直接影響微生物的產量，從而影響飼料粗蛋白的含量，時間過長則容易將已降解的氨基酸和小肽降解為氨揮發(fā)掉，致使飼料粗蛋白降低。所以試驗所用的三種菌種發(fā)酵時間控制在60 h時效果最佳。發(fā)酵時溫度對果蔬濃漿液體飼料也有重要影響，溫度適中時，繁殖出微生物有利于保證發(fā)酵品質，所以酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵溫度應控制在30℃，而植物乳桿菌發(fā)酵溫度則應控制在40℃。此外，接種量對生物量也有部分影響，接種量少，發(fā)酵液體飼料中有益菌濃度低，則雜菌會利用飼料中營養(yǎng)物質加速繁殖；接種量過多則會造成競爭底物，不利于有益菌生殖。所以酵母菌接種量為2.5%，枯草芽孢桿菌接種量為4%，植物乳酸菌接種量為3%。pH值對發(fā)酵果蔬濃漿液飼料的影響主要體現的在乳酸產量上，吳勝華等用酵母菌發(fā)酵普通生豆粕時，通過正交試驗得到最佳發(fā)酵條件中自然pH值、情況下豆粕中小肽含量提高了4.3倍。

3.2 經3種不同的菌種發(fā)酵后，果蔬濃漿液飼料的營養(yǎng)價值有了明顯的提高，主要是由于發(fā)酵中產生了多種消化酶，如枯草芽孢桿菌可產生蛋白酶、纖維素酶、果膠酶，可以破壞細胞壁成分，使營養(yǎng)物質釋放出來；酵母菌則可合成菌體蛋白，提高飼料中蛋白質含量；植物乳桿菌則可將糖分轉化成乳酸，提高果蔬濃漿液中乳酸含量，均大大提高了飼料的營養(yǎng)價值。

3.3 經3種不同的菌種混菌發(fā)酵后，果蔬濃漿液飼料的營養(yǎng)價值比單菌發(fā)酵更有所提高，主要是由于菌種產生的多種消化酶共同作用的結果，比單一菌種發(fā)酵營養(yǎng)價值提升更加明顯。

4 結論

4.1 本試驗通過正交試驗獲得了不同菌種發(fā)酵果蔬濃漿液體飼料的最佳優(yōu)化條件，其中酵母菌最佳優(yōu)化條件為發(fā)酵時間60 h、溫度30℃、pH值6.0、接種量3%；枯草芽孢桿菌最佳優(yōu)化條件為溫度30℃、發(fā)酵時間60 h、pH值5、接種量4%；植物乳桿菌最佳優(yōu)化條件為發(fā)酵時間60 h、溫度40℃、接種量3%、pH值6。在各菌種最佳優(yōu)化條件下果蔬液體飼料發(fā)酵效果最好。

4.2 最佳優(yōu)化條件下，對各菌種發(fā)酵的果蔬液體飼料營養(yǎng)價值均有所提高，經酵母菌發(fā)酵果蔬濃漿液飼料，粗蛋白含量比發(fā)酵前上升6.59%，粗纖維含量減小20.83%，乳酸含量增加約7.38倍，鈣、磷含量也有不同程度的增加。經枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，粗蛋白含量比發(fā)酵前上升8.24%，粗纖維含量減小12.5%，乳酸含量成幾何倍數增加，鈣、磷含量同樣也有不同程度的增加。經植物乳桿菌發(fā)酵后，粗蛋白含量比發(fā)酵前上升6.43%，粗纖維含量減小10.22%，乳酸含量成幾何倍數增加，鈣含量上升64%，磷含量上升28.57%。

4.3 將上述3種菌按最佳發(fā)酵條件混菌發(fā)酵后，飼料營養(yǎng)價值比單一菌種發(fā)酵的營養(yǎng)價值有所提高，粗蛋白含量比發(fā)酵前上升9.2%，達到19.88%；粗纖維含量降低至2.01%；乳酸、生物量、Ca、P也有明顯的提升，分別提高至61.88 g/l、162.73×106cfu/ml、0.99%和0.91%。